《Molecular & Cellular Proteomics》：Longitudinal Spatial Proteomics of Breast Cancer Reveals Recurrent Phenotypic Clone States and Temporal Trajectories
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肿瘤内异质性（intratumoral heterogeneity）使乳腺癌的治疗应答与复发复杂化，然而保留组织结构的纵向空间研究仍然匮乏。研究人员在此整合了基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI-MSI）与区域分辨的dia-PASEF蛋白质组学，以绘制跨系
肿瘤内异质性（intratumoral heterogeneity）使乳腺癌的治疗应答与复发复杂化，然而保留组织结构的纵向空间研究仍然匮乏。研究人员在此整合了基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI-MSI）与区域分辨的dia-PASEF蛋白质组学，以绘制跨系列乳腺癌标本的复发性空间蛋白质组程序图谱。研究人员分析了来自16例患者的47份福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织，涵盖原发肿瘤、复发灶及转移灶。队列水平的MSI共分割提供了一个包含10个复发性光谱状态的通用参考图谱，病理学家引导的201个含肿瘤区域的微提取产生了402份提取水平蛋白质组数据集。由于未进行基因组谱系追踪，研究人员使用术语“复发性空间蛋白质组状态”来指代一种空间定位的、复发的蛋白质组表型，而非经遗传学证实的克隆。在激素受体阳性、HER2阳性以及激素受体阴性/HER2低表达疾病中均观察到复发性空间蛋白质组状态，表明相似的空间程序可在不同临床亚型中复发。代表性患者的纵向分析显示治疗期间显著的状态更替，部分状态持续存在，而其他状态在复发或转移进展时出现。特征排序模型识别了与各空间状态及临床采样阶段相关的蛋白质，而探索性富集分析提示从早期免疫和激素相关程序向晚期炎症、侵袭及应激适应程序的广泛转变。由于队列规模有限、同一患者重复区域并非独立样本，且缺乏外部验证队列，所有预测性和治疗性解读均作为假设生成性结论呈现。这些数据提供了乳腺癌复发性空间蛋白质组状态的空间蛋白质组图谱，以及研究进展和治疗期间受约束但非确定性进化轨迹的框架。
论文解读
一、研究背景与科学问题
乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤之一，也是癌症相关死亡的主要原因。尽管治疗取得了进展，复发和转移性进展仍持续限制着持久的疾病控制。肿瘤内异质性（intratumoral heterogeneity）是导致这一困境的关键因素：肿瘤包含空间和时间上不同的细胞群体，它们在信号传导、代谢、应激反应、药物敏感性以及与周围微环境的相互作用方面存在差异。这种异质性不仅存在于诊断时，而且贯穿整个疾病过程，因为治疗可能抑制某些细胞群体，同时允许其他群体持续存在、适应或扩增。
经典的Nowell克隆进化模型将癌症视为由变异和选择塑造的达尔文式过程，该框架至今仍然基础性重要。然而，当前证据也强调非遗传可塑性、生态约束和表型状态转换的作用。在乳腺癌中，临床上重要的转变，如受体转换、免疫浸润变化、侵袭程序改变以及耐药持续状态的产生，可能通过遗传和非遗传过程的组合而发生。因此，纵向肿瘤行为既非完全随机也非完全确定，而是受肿瘤可用状态库以及治疗和微环境施加的选择压力所约束。
值得注意的是，由于未进行基因组测序或谱系追踪，该研究避免将空间状态等同于遗传亚克隆。研究中使用的“复发性空间蛋白质组状态”是一个操作性实体：由MSI界定、蛋白质组学注释的空间定位区域，呈现复发性蛋白质组表型。此类状态可能反映肿瘤上皮、间质、免疫浸润、血管或混合组织区室的多种贡献。
解析这种受约束的进化需要既保留组织结构又提供分子深度的技术。基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI-MSI）可在无标记条件下跨组织切片绘制肽段图谱，而区域分辨液相色谱串联质谱则可从空间界定区域鉴定蛋白质。两者结合可直接在肿瘤的组织学背景下描述空间定位的蛋白质组表型。
二、研究设计与技术方法
研究人员利用来自16例患者的系列样本和47份福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）标本，结合MALDI-MSI、空间微提取、dia-PASEF蛋白质组学以及探索性特征排序分析，旨在构建队列水平的复发性空间蛋白质组状态图谱，描述代表性纵向病例中的状态更替，并检查队列中广泛的阶段相关蛋白质组转变。所有机制性和治疗性解读均明确表述为假设生成性结论。
样本来源于法国里尔Oscar Lambret中心，由资深乳腺病理学家根据疾病过程中的系列样本可用性选择。队列包含2012年至2022年间收集的47份FFPE组织，涵盖原发肿瘤、新辅助治疗后残留病灶、局部区域复发、淋巴结复发和远处转移。患者层面包括4例激素受体阳性/HER2低表达或阴性、7例HER2阳性、5例激素受体阴性/HER2低表达或阴性病例。
关键技术方法包括：肽段MALDI质谱成像，通过SVD压缩和k-means++聚类实现无监督分割；空间分辨蛋白质组学提取，对201个MSI界定的含肿瘤区域进行重复分析，产生402份提取水平蛋白质组数据集；nanoLC-MS/MS结合dia-PASEF采集；DIA-NN软件进行肽段鉴定和蛋白质定量；以及包括随机森林、LIME和SHAP在内的机器学习和可解释人工智能方法用于特征排序和生物标志物发现。
三、研究结果
队列概述与操作性状态定义。 研究分析了来自16例患者的47份FFPE组织样本，涵盖三种乳腺癌亚型。通过定制MSI流程（SVD压缩加k-means++聚类）进行无监督分割，每份样本产生8至15个不同聚类，每个聚类具有特定蛋白质组特征。这些聚类被称为表型克隆（不暗示遗传克隆性），反映了潜在的肿瘤内异质性。
纵向病例研究：个体患者中微环境驱动的进化。 通过共同配准和共同分割单个患者所有可用时间点的MALDI-MSI数据，研究人员描述了三位代表性患者的动态变化。患者2（初始HR+/HER2低表达）显示随化疗和复发，聚类组成显著更替，后期样本出现增加的异质性和多个新聚类。患者11（HER2+）在曲妥珠单抗治疗下显示部分状态持续和部分状态消失，伴随从HR?/HER2+到HR+/HER2-low的亚型转变。患者18（三阴性乳腺癌）显示持续异质性和进化中的亚群结构，晚期转移样本与特定聚类强关联。
队列水平MSI共分割揭示跨临床亚型的复发性空间蛋白质组状态。 跨全队列进行共分割分析，基于Silhouette准则识别出10个聚类作为操作性参考。相似状态在激素受体阳性/HER2低表达或阴性、HER2阳性和激素受体阴性/HER2低表达或阴性肿瘤中均观察到，没有聚类完全局限于单一临床亚型。这支持肿瘤可能从共同表型状态库中取用的模型，差异源于这些状态的相对组成和空间组织。
区域分辨蛋白质组学识别状态相关蛋白质和广泛生物学程序。 状态引导的微提取产生402份蛋白质组图谱，分布于11个类别。特征排序方法识别了各状态的可重复标记蛋白集。功能富集分析显示：黄色状态富集雌激素应答和甾醇代谢通路；蓝色状态富集免疫信号和外源物代谢；紫色状态富集上皮-间质转化（EMT）和TGF-β相关过程；橙色状态与增殖和KRAS相关信号相关；红色状态显示胆固醇稳态和代谢应激通路富集。药物-靶标交叉参考作为假设生成性探索呈现。
阶段相关分组揭示广泛蛋白质组转变但受患者和组织背景混杂。 将402份微提取数据集按活检时间点分组，比较分析显示早期和中间阶段相似性较强，晚期阶段更为独特。特征排序识别了各阶段相关蛋白，通路分析提示从早期免疫相关过程向晚期炎症和应激适应特征的转变。但阶段与患者身份、组织来源和治疗暴露相混杂。
整合时空可视化提示状态随时间再分布。 将时间点注释投影到蛋白质组状态嵌入上，提示早期样本更常与激素应答、中间或休眠样状态相关，而晚期样本显示应激适应、侵袭或炎症状态的增加代表。中间阶段显示更大异质性，包括侵袭和增殖状态的产生。
四、讨论与结论
讨论部分强调，最稳健的结论是复发性空间蛋白质组状态在不同临床亚型肿瘤中重现，这并不否定基于受体的亚型分类，但表明肿瘤内组织在经典受体状态之外的额外轴上运行。研究明确将“复发性空间蛋白质组状态”这一操作性术语与遗传克隆性分离，强调没有DNA测序、谱系追踪或正交单细胞数据，这些状态不能被解释为遗传亚克隆。
研究承认多项局限性：队列规模小且亚型不平衡；采样跨越十年可能存在标本年龄或分析批次相关的未建模效应；阶段、治疗、组织部位和患者身份强烈混杂；未进行基因组克隆性分析、混合效应纵向建模、患者分块外部验证或正交细胞类型映射；全局跨运行归一化和缺失值插补可能影响定量景观；Time 4仅由12份提取水平图谱代表。
结论指出，纵向空间蛋白质组学鉴定了跨乳腺癌亚型的复发性空间蛋白质组状态，并记录了治疗、复发和转移期间显著的状态再分布。这些状态应被解释为蛋白质组组织表型而非遗传学证实的克隆。通过结合MSI与区域分辨蛋白质组学，该研究提供了复发性空间程序的描述性图谱，以及未来患者感知验证受约束肿瘤进化的框架。该方法的临床价值将取决于更大队列、正交谱系和细胞类型验证，以及此处产生的探索性假设的前瞻性测试。
