超越生物防治：绿僵菌分离株对牧草物种依赖性促生长效应

《Journal of Basic Microbiology》：Beyond Biocontrol: Species-Dependent Growth Promotion of Forage Grasses by Metarhizium anisopliae Isolates

　　

关于用于生物防治项目的昆虫病原真菌与牧草物种间相互作用的研究仍然有限。本研究评估了用五种本地和两种商业绿僵菌（Metarhizium anisopliae）分离株接种牧草物种宽叶雀稗（Axonopus catharinensis cv. SCS315 Catarina Gigante）、牛鞭草（Hemarthria altissima cv. Florida）和狗牙根（Cynodon dactylon cv. Tifton 85）幼苗的效果。植物生长反应因真菌分离株和牧草物种而异。在狗牙根和宽叶雀稗中，特定分离株显著增加了叶片和根的鲜重与干重、叶片数量以及植株高度。相比之下，牛鞭草通常未观察到类似的积极效果，某些分离株甚至降低了其部分生长参数。综合考虑整体植物表现（地上部和根部性状），分离株CEPAF_ENT25、CEPAF_ENT27和IBCB425在促进宽叶雀稗和狗牙根生长方面尤为有效。根部接种成功建立了真菌-植物互作，从所有评估的植物组织（根、茎和叶）中均重新分离到绿僵菌属（Metarhizium spp.），其中根部定殖频率最高。尽管所有分离株均可从基质中重新分离，但其回收率随时间推移而下降。这些发现表明，不同绿僵菌分离株的植物促生长效应以及不同牧草物种的反应性存在显著差异。研究结果凸显了选定分离株作为多功能生物制剂用于可持续牧场系统的潜力。

研究背景与目的

巴西南部地区以小规模家庭农场为主，畜牧业严重依赖天然和人工牧场，面积约1.77亿公顷。然而，牧场生产力常受到沫蝉科（Cercopidae）害虫的限制，其危害可导致产量损失高达80%。昆虫病原真菌金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）已被广泛用作生物防治剂。近年研究发现，该真菌不仅能控制害虫，还能作为多功能的植物共生微生物，通过根际定殖和内生关系促进植物生长、改善营养品质。然而，此前尚无研究探讨本地绿僵菌分离株对巴西南部关键牧草物种——宽叶雀稗（Axonopus catharinensis）、牛鞭草（Hemarthria altissima）和狗牙根（Cynodon dactylon）的内生定殖及促生长效应。因此，研究人员假设这些本地分离株能在牧草中建立内生关系并增强植物活力和生物量，同时这种互作效应会因真菌分离株和寄主物种的不同而变化。本研究旨在评估五个来自圣卡塔琳娜州牧区的本地绿僵菌分离株和两个商品化分离株对上述三种牧草的促生长作用、光合色素水平影响，并确认其在植物组织中的内生定殖以及在基质中的持久性。

研究方法与技术

1. 1.
   供试材料与接种处理：选取宽叶雀稗、牛鞭草和狗牙根的茎段扦插苗。试验所用绿僵菌分离株包括五个本地分离株（CEPAF_ENT25、CEPAF_ENT26、CEPAF_ENT27、CEPAF_ENT42、CEPAF_ENT59，均分离自巴西圣卡塔琳娜州牧区土壤）和两个商品分离株（IBCB425和E9）。采用根部浸蘸法，将幼苗根系浸泡于浓度为1×10⁸ 分生孢子/mL的悬浮液中30分钟进行接种。
2. 2.
   生长参数测定：接种后40天，测量植物的叶片数、分蘖数、最长茎和根的长度，以及地上部和根部的鲜重与干重。
3. 3.
   光合色素含量测定：对表现出促生长潜力的物种，采集植株中部叶片，使用80%丙酮提取后，通过分光光度法测定叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的含量。
4. 4.
   内生定殖检测：在接种后10、20和40天，分别采集根、茎、叶组织样品，经表面消毒后，置于选择性培养基上培养，通过显微镜观察特征性结构（分生孢子梗和分生孢子）来确认绿僵菌的内生定殖情况。
5. 5.
   基质中真菌持久性测定：在相同时间点，采集根际基质样品，稀释涂布于选择性培养基上，计数菌落形成单位（CFU）以评估真菌在基质中的存活与繁殖能力。

研究结果

3.1 绿僵菌分离株对牧草物种生长的影响

用绿僵菌分离株处理不同牧草幼苗对所有营养生长参数均有显著影响，且牧草物种与真菌分离株之间存在显著的交互作用。

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  叶片鲜重与干重：在狗牙根中，多数分离株（除E9外）提高了叶片鲜重和干重。在牛鞭草中，仅E9分离株提高了叶片鲜重，而CEPAF_ENT25、CEPAF_ENT27和IBCB425提高了其叶片干重。在宽叶雀稗中，CEPAF_ENT25和CEPAF_ENT27显著提高了其叶片干重。
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  叶片数与分蘖数：狗牙根对接种反应最积极，尤其是CEPAF_ENT25使叶片数增加65.3%。对于宽叶雀稗，CEPAF_ENT25、CEPAF_ENT27、E9和IBCB425增加了叶片数。牛鞭草的叶片数和分蘖数均未受显著影响。狗牙根的分蘖数在多个分离株（如CEPAF_ENT25、IBCB425等）处理下增加。
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  株高与根长：除E9外，所有来自圣卡塔琳娜州的本地分离株均显著增加了狗牙根的株高。CEPAF_ENT25和CEPAF_ENT27使宽叶雀稗的株高分别增加38.05%和28.11%。所有分离株均未影响牛鞭草的株高。仅CEPAF_ENT59和IBCB425增加了狗牙根的根长。
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  根鲜重与干重：在狗牙根中，无分离株增加根鲜重或干重。在牛鞭草中，多数分离株显著降低了根鲜重和干重。相反，CEPAF_ENT25、CEPAF_ENT26和CEPAF_ENT27增加了宽叶雀稗的根鲜重，除E9外的所有分离株均增加了其根干重。

3.2 绿僵菌分离株处理牧草的光合色素水平

在宽叶雀稗中，分离株CEPAF_ENT25、CEPAF_ENT26和CEPAF_ENT59使叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素水平相比对照组提高超过20%。而在狗牙根中，测试的所有分离株均未引起光合色素的显著变化。

3.3 选定分离株的内生定殖与基质回收

接种的真菌在狗牙根和宽叶雀稗的所有部位均被确认存在。定殖率随时间推移而下降，在接种后10天最高，40天最低。根部定殖频率普遍高于茎和叶。在宽叶雀稗中，CEPAF_ENT59和CEPAF_ENT26在整个评估期间保持较高的定殖率。在狗牙根中，接种后10天茎部定殖率最高（54.43%），CEPAF_ENT26在10天时定殖率最高（55.83%），而CEPAF_ENT59在20天时达到64.17%。从基质中回收的CFU计数也随时间逐渐减少。

讨论与结论

本研究表明，通过根部浸蘸法接种绿僵菌能有效在牧草幼苗中建立内生关系，定殖效果因植物种类和真菌分离株而异。真菌在根部的定殖最为常见，这与先前研究一致。植物与内生真菌的互作受多种因素影响，本研究中，绿僵菌对狗牙根和宽叶雀稗表现出显著的促生长作用，但对牛鞭草则未产生类似益处，甚至在某些参数上有抑制作用。这反映了不同牧草物种与真菌分离株之间的相容性差异。在相容性较差的组合中，真菌的建立可能无法转化为生长促进，反而因防御激活或养分竞争而产生代谢成本。研究还发现，特定分离株（如CEPAF_ENT25和CEPAF_ENT26）能显著提升宽叶雀稗的光合色素含量，这可能与真菌满足自身碳需求有关。虽然所有分离株均能从基质中回收，但回收率随时间下降，表明可能需要周期性施用以维持效果。研究人员指出，尽管根部浸蘸法在研究层面有效，但对于大规模牧场应用，更需探索种子处理、土壤施用等更具扩展性的策略。

研究结论：本地分离株CEPAF_ENT25和CEPAF_ENT27，以及商品分离株IBCB425，成功地在宽叶雀稗和狗牙根中建立了内生关系，并导致了生物量的增加。探索针对特定生态气候条件和牧草物种的新型昆虫病原真菌分离株，有望催生创新产品。这项研究对于加强牧场综合害虫管理（IPM）策略至关重要，在该策略中，绿僵菌属的分生孢子常用于控制沫蝉种群并改善牧草植物营养。