《Journal of Cell Communication and Signaling》：Integrated single-cell transcriptomics reveals miR-941 targets CLDN4 to inhibit malignant progression of thyroid cancer through the PI3K/AKT signaling pathway
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紧密连接蛋白Claudin-4（CLDN4）在肿瘤进展中发挥重要作用，但其在甲状腺癌中的功能角色及调控机制尚不明确。本研究旨在探讨CLDN4对恶性进展的贡献及其与肿瘤免疫微环境的相互作用。研究人员整合了单细胞和 bulk 转录组数据以鉴定CLDN4相关的恶性上
紧密连接蛋白Claudin-4（CLDN4）在肿瘤进展中发挥重要作用，但其在甲状腺癌中的功能角色及调控机制尚不明确。本研究旨在探讨CLDN4对恶性进展的贡献及其与肿瘤免疫微环境的相互作用。研究人员整合了单细胞和 bulk 转录组数据以鉴定CLDN4相关的恶性上皮亚群。通过qRT-PCR、蛋白质印迹法和免疫组织化学法在25对甲状腺乳头状癌（PTC）组织中验证了CLDN4的表达。利用过表达和敲低CLDN4的B-CPAP和TPC-1细胞进行功能实验。通过荧光素酶报告基因实验验证了miR-941与CLDN4的相互作用。在体外评估了PI3K/AKT信号传导和巨噬细胞极化，并在异种移植小鼠模型中评估了肿瘤生长。研究人员鉴定出一个CLDN4高表达的上皮亚群，其与晚期肿瘤分期和PI3K/AKT激活相关。CLDN4在PTC组织中上调，而miR-941下调。高CLDN4表达与较大的肿瘤尺寸、淋巴转移和血管迁移相关。CLDN4过表达促进增殖、迁移、集落形成和抗凋亡，而敲低则产生相反效果。miR-941直接靶向CLDN4并减弱其致癌效应。CLDN4激活PI3K/AKT信号，而PI3K抑制可逆转这些表型。CLDN4还促进M2型巨噬细胞极化并抑制M1型极化。在体内，CLDN4增强肿瘤生长，该作用可被PI3K阻断所抑制。miR-941通过调控PI3K/AKT通路抑制CLDN4从而阻碍PTC进展。这些发现为肿瘤进展和免疫微环境重塑提供了机制性见解，并凸显了CLDN4作为潜在治疗靶点的价值。
论文解读文章
一、研究背景与目的
甲状腺癌是全球发病率增长最快的恶性肿瘤之一，其中甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma, PTC）约占所有病例的80%。尽管大多数PTC患者预后良好，但仍有部分患者出现局部侵袭、远处转移或对常规治疗耐药，导致疾病进展和不良临床结局。因此，阐明甲状腺癌发生的分子机制并寻找新的诊断标志物和治疗靶点至关重要。
紧密连接蛋白Claudin-4（CLDN4）是构成紧密连接的关键蛋白，其在多种肿瘤中的作用具有组织特异性：在前列腺癌、乳腺癌和卵巢癌中高表达并促进上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）和肿瘤扩散，而在胃癌和胰腺导管腺癌中高表达反而抑制肿瘤侵袭并与较好预后相关。然而，CLDN4在甲状腺癌中的功能角色和调控机制尚不清楚。此外，人类特异性microRNA miR-941已被发现在多种癌症细胞系中表达升高，但其对甲状腺肿瘤细胞的生物学效应尚未明确。基于此，本研究旨在通过整合单细胞和bulk转录组学分析，结合体外和体内功能实验，探究CLDN4在甲状腺癌恶性进展中的作用及其上游调控机制。
二、研究方法概述
研究人员首先从GEO数据库获取6例PTC患者的配对肿瘤和癌旁正常组织的单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）数据（GSE184362和GSE250521），并使用Seurat包进行数据处理和分析。同时从癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA-THCA）数据库获取bulk RNA-seq表达谱和临床信息。将bulk和单细胞转录组数据进行整合分析，筛选出与PTC进展相关的上皮特异性基因。在25对南方医科大学第十附属医院手术切除的PTC组织和配对的癌旁正常组织中进行qRT-PCR、蛋白质印迹法和免疫组织化学染色验证。使用慢病毒构建稳定过表达和敲低CLDN4的B-CPAP和TPC-1细胞系，通过CCK-8实验、划痕愈合实验、Transwell迁移实验、集落形成实验和流式细胞术检测细胞功能变化。双荧光素酶报告基因实验验证miR-941与CLDN4的靶向关系。通过共培养体系和流式细胞术检测巨噬细胞极化。最后，在BALB/c裸鼠皮下异种移植模型中评估CLDN4对肿瘤生长的影响。
三、研究结果
3.1 单细胞转录组景观揭示PTC中细胞组成改变
通过对6例配对PTC样本的scRNA-seq数据整合分析，研究人员鉴定了10种主要细胞类型，包括B细胞、浆细胞、T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、浆细胞样树突状细胞、成纤维细胞、内皮细胞、淋巴管内皮细胞和上皮细胞。比较分析显示，PTC组织中T细胞比例普遍高于配对正常组织，而上皮细胞在肿瘤组织中的比例增加。进一步提取上皮细胞进行亚聚类分析，发现肿瘤上皮细胞与正常上皮细胞在转录水平上存在显著差异。KEGG通路富集分析表明，肿瘤上皮细胞中PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路和细胞黏附相关通路显著富集。此外，髓系细胞亚聚类分析鉴定出一个CCL18表达的巨噬细胞亚群（Macro_CCL18），该亚群在肿瘤组织中比例较高。
3.2 整合分析鉴定CLDN4为PTC进展相关上皮基因
通过整合TCGA-THCA的bulk RNA-seq差异表达基因与scRNA-seq的上皮细胞特异性基因，研究人员获得四个上皮富集的差异表达基因：MGST1、NKX2-1、CLDN4和CLDN7。进一步比较发现，CLDN4和MGST1在肿瘤上皮细胞中显著上调，但只有CLDN4的表达与病理肿瘤分期呈显著正相关。根据CLDN4中位表达水平将TCGA样本分为高表达组和低表达组，差异表达基因的KEGG分析显示高CLDN4组中PI3K-AKT信号通路显著富集。细胞间通讯分析表明，CLDN4高表达的肿瘤上皮细胞与Macro_CCL18巨噬细胞亚群之间存在显著的配体-受体相互作用，包括SPP1-CD44和ANXA1-FPR3信号轴。
3.3 CLDN4在甲状腺癌组织中高表达
在25对临床样本中，qRT-PCR结果显示CLDN4 mRNA在肿瘤组织中显著上调，而miR-941表达显著下调。蛋白质印迹法和免疫组织化学染色进一步证实CLDN4蛋白在肿瘤组织中高表达。GEPIA数据库的外部验证也显示CLDN4在512例甲状腺肿瘤样本中表达显著高于337例正常甲状腺组织。对82例甲状腺癌患者的临床病理分析表明，高CLDN4表达与较大肿瘤尺寸（≥3.2 cm）、淋巴转移、远处转移和血管侵犯显著相关。
3.4 CLDN4促进B-CPAP细胞增殖、迁移并抑制凋亡
在五种甲状腺细胞系中，B-CPAP细胞显示出最高的CLDN4表达水平，因此被选为主要功能研究模型。通过慢病毒转染建立稳定过表达和敲低CLDN4的B-CPAP细胞系后，CCK-8实验表明CLDN4过表达显著促进细胞增殖，而敲低则抑制细胞活力。划痕愈合实验和Transwell实验均显示CLDN4过表达增强细胞迁移能力。集落形成实验进一步证实CLDN4过表达增加集落形成能力。流式细胞术检测显示CLDN4过表达减少细胞凋亡，而敲低则加速凋亡。
3.5 miR-941直接靶向CLDN4并抑制其驱动的恶性表型
将miR-941模拟物和抑制剂转染至B-CPAP细胞后，蛋白质印迹法显示miR-941模拟物显著抑制CLDN4蛋白表达，而miR-941抑制剂则增强其表达。双荧光素酶报告基因实验证实miR-941直接结合CLDN4的3‘非翻译区（3’-UTR）。功能挽救实验表明，CLDN4过表达显著增强细胞活力、迁移能力和集落形成能力并减少凋亡，而miR-941模拟物可抑制这些效应，且CLDN4共过表达可部分恢复这些表型。
3.6 CLDN4激活PI3K/AKT通路，该作用可被miR-941逆转
蛋白质印迹法分析显示，CLDN4过表达显著上调磷酸化PI3K（p-PI3K）和磷酸化AKT（p-AKT）水平，并下调PTEN表达，而不影响总PI3K和总AKT水平。CLDN4敲低则产生相反效果。miR-941模拟物转染导致p-PI3K和p-AKT降低、PTEN升高，而miR-941抑制剂则产生相反效果。重要的是，CLDN4过表达诱导的PI3K/AKT通路激活可被miR-941模拟物有效逆转。
3.7 CLDN4通过PI3K/AKT信号促进恶性表型
使用PI3K特异性抑制剂LY294002处理CLDN4过表达的B-CPAP细胞后，CCK-8实验显示LY294002显著抑制细胞活力，而CLDN4过表达可部分挽救该抑制作用。划痕愈合实验、集落形成实验和Transwell实验均表明LY294002抑制细胞迁移和增殖能力，而CLDN4过表达可逆转这些抑制效应。
3.8 miR-941在TPC-1细胞中抑制CLDN4驱动的恶性表型
在另一PTC细胞系TPC-1中进行的验证实验得到了一致的结果：CLDN4过表达促进细胞活力、迁移和集落形成，而miR-941模拟物抑制这些效应，且CLDN4共过表达可部分恢复这些表型。
3.9 CLDN4调节肿瘤相关巨噬细胞极化
将THP-1来源的巨噬细胞与稳定过表达或敲低CLDN4的B-CPAP细胞共培养后，流式细胞术分析显示，与CLDN4过表达肿瘤细胞共培养后，M1型巨噬细胞（CD45+CD86+）比例显著降低，而M2型巨噬细胞（CD45+CD206+）比例显著升高。CLDN4敲低则产生相反效果。
3.10 CLDN4通过PI3K信号在体内促进肿瘤生长
在BALB/c裸鼠皮下异种移植模型中，CLDN4过表达组肿瘤生长显著加快，最终肿瘤体积约为对照组的两倍；而CLDN4敲低组肿瘤生长明显减缓，体积缩小至对照组的约六分之一。LY294002处理可显著抑制CLDN4过表达诱导的肿瘤促进作用。免疫组织化学分析显示，CLDN4表达水平与Ki67阳性率呈正相关。
四、讨论与结论
本研究通过综合分析临床标本、细胞模型和体内实验，阐明了CLDN4在甲状腺癌中的促癌作用及其调控机制。研究发现CLDN4在甲状腺癌中显著上调，其高表达与肿瘤大小、淋巴转移和血管侵犯等恶性特征相关。miR-941被鉴定为CLDN4的直接上游调控因子，通过靶向其3‘-UTR抑制CLDN4表达，进而逆转CLDN4驱动的恶性表型。机制上，CLDN4通过激活PI3K/AKT信号通路促进肿瘤进展，而PI3K抑制剂LY294002可有效阻断这一效应。此外，CLDN4还可通过促进M2型巨噬细胞极化和抑制M1型极化来重塑肿瘤免疫微环境。
研究结论部分指出：总之，本研究整合了单细胞和bulk转录组分析以及功能验证，揭示了PTC中与PI3K/AKT通路激活相关的CLDN4高表达恶性上皮亚群。研究人员证明miR-941直接靶向CLDN4以在体外和体内抑制肿瘤进展，并且CLDN4通过激活PI3K/AKT信号通路促进恶性表型。在25对PTC组织中的临床验证确认CLDN4显著上调而miR-941下调，高CLDN4表达与较大的肿瘤尺寸、淋巴转移和血管侵犯相关。此外，研究人员提供的证据表明肿瘤细胞中CLDN4的表达促进M2型巨噬细胞极化同时抑制M1型极化，提示其在重塑肿瘤免疫微环境中的作用。综上所述，这些发现确立了miR-941/CLDN4/PI3K/AKT轴作为PTC进展的关键调控因子，并凸显了CLDN4作为精准肿瘤学中一个有前景的治疗靶点。
