《Journal of Comparative Neurology》：A Species-Dependent Spatial Patterning of FOXP1 and nNOS Protein Expression in the Adult Mammalian Subthalamic Nucleus
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丘脑底核（subthalamic nucleus，STN）是基底神经节环路的关键组成部分，参与运动、认知和边缘功能。转录因子FOXP1已被证实与神经发育障碍及基底神经节功能相关，但其在成年STN中的表达仍未得到充分表征。本研究检测了FOXP1蛋白及其与神经元型
丘脑底核（subthalamic nucleus，STN）是基底神经节环路的关键组成部分，参与运动、认知和边缘功能。转录因子FOXP1已被证实与神经发育障碍及基底神经节功能相关，但其在成年STN中的表达仍未得到充分表征。本研究检测了FOXP1蛋白及其与神经元型一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase，nNOS）和泛神经元标志物（HuC/HuD）在三种哺乳动物物种（小鼠、大鼠和人）成年STN中的表达与分布情况。研究人员采用免疫荧光双标及定量分析方法，考察了上述标志物在神经元群体中的空间组织及相对比例。研究结果显示，FOXP1构成一个重要的神经元亚群，在全部物种中约占STN神经元的40%–45%。相比之下，nNOS阳性神经元呈现显著的物种间差异，其比例从小鼠的约32%递增至人类的约68%。值得注意的是，上述标志物的空间分布在不同物种间存在显著差异：在啮齿类动物中，FOXP1阳性与nNOS阳性神经元沿背腹轴大致分离，形成清晰可辨的亚区；而在人类STN中，这两类神经元群体弥漫性混合分布，共定位程度更高。此外，两种标志物均呈现物种特异性的前后（antero-posterior）梯度表达。上述发现首次提供了FOXP1蛋白在成年大鼠和人类STN中表达的证据，并揭示了神经元组织的根本性物种间差异。人类中nNOS阳性群体的扩张及FOXP1/nNOS共定位程度的增加提示哺乳动物STN细胞构筑存在进化分化。总体而言，本研究结果对哺乳动物（尤其是灵长类）STN亚区划分的简化模型提出了挑战，并强调在将啮齿类动物数据外推至人类神经生理学时需保持审慎。
论文解读：FOXP1与nNOS在成年哺乳动物丘脑底核中的物种依赖性空间表达模式
一、研究背景与科学问题
丘脑底核（subthalamic nucleus，STN）是基底神经节环路中一个体积较小但功能重要的皮质下结构，除经典的运动控制功能外，还深度参与认知与边缘（limbic）过程。转录因子FOXP1属于叉头框（Forkhead box）基因家族，该家族在哺乳动物脑中表达的有FOXP1、FOXP2和FOXP4三种成员。FOXP1功能缺失与多种神经发育障碍密切相关：全身性Foxp1纯合敲除小鼠因心脏形态发生严重缺陷在胚胎期E14.5死亡；杂合敲除新生小鼠表现异常超声发声，成年后出现握力受损与多动；脑特异性条件敲除小鼠则表现出多动、重复行为增加、短期记忆受损、社交行为异常、焦虑减少及注意力加工障碍，并伴随海马和纹状体的形态学异常。在人类中，FOXP1基因的破坏性突变（缺失和重复）可导致FOXP1综合征，表现为发育和言语迟缓、运动缺陷、睡眠问题、智力障碍以及多种精神症状，包括注意缺陷/多动障碍（ADHD）症状、攻击行为、强迫症状、情绪障碍、焦虑及自闭症谱系障碍症状。值得注意的是，上述许多行为症状可与STN功能（或功能障碍）相关联，如注意力不集中、冲动性、攻击性和重复行为等。
然而，FOXP1在STN中的表达数据极为匮乏。在发育和成年小鼠脑中，Foxp1 mRNA在纹状体和黑质等基底神经节结构中已有报道，但关于其在STN中的表达，不同研究结果并不一致：Tamura等人（2004）报道成年小鼠STN中缺乏Foxp1 mRNA信号，而RNA测序研究检测到小鼠STN中存在Foxp1 mRNA，Skidmore等人（2008）通过免疫荧光检测到小鼠STN中的FOXP1蛋白表达。在人类中，22孕周胎儿STN中发现了Foxp1 mRNA，13孕周的人类胎儿STN中已检测到FOXP1蛋白，但成年人类STN中FOXP1的表达此前未见报道，大鼠STN中亦无相关数据。鉴于大鼠是神经科学中重要的模式物种，这一空白亟需填补。另一方面，神经元型一氧化氮合酶（nNOS，由Nos1基因编码）在STN中的表达已有较多跨物种研究：约95%的人类丘脑底神经元表达Nos1 mRNA，约90%表达nNOS蛋白；大鼠和小鼠STN中亦报道有nNOS阳性细胞，但具体比例和空间分布尚不完全清楚。
基于上述背景，本研究旨在：（1）首次系统比较FOXP1蛋白在成年小鼠、大鼠和人类STN中的表达与分布；（2）确定FOXP1与nNOS及泛神经元标志物HuC/HuD的共定位情况，比较三种哺乳动物物种中这些标志物的表达谱和分布模式。
二、主要技术方法
研究人员从三种成年哺乳动物物种获取STN样本：3.5月龄雄性Wistar Han大鼠（3只）、3.5月龄雄性C57BL/6小鼠（3只）以及3例来自萨格勒布人类脑库的成年人类脑标本（均为男性白种人，死亡原因分别为心脏病发作、窒息和肺炎，死后间隔11–24小时）。啮齿类动物经心脏灌注固定，人类脑组织经浸泡固定后石蜡包埋，切片厚度10 μm。采用免疫荧光双标技术，将FOXP1抗体分别与nNOS抗体及泛神经元标志物HuC/HuD抗体组合标记，以DAPI复染细胞核。使用Olympus FV3000激光共聚焦显微镜采集图像，通过Neurolucida软件对免疫反应阳性（IR）细胞进行数字化标记和定量计数。每个物种使用3个脑标本，分别分析STN前部、中央和后部三个区域，每种双标组合均进行定量。神经元密度以每立方毫米阳性细胞数表示，FOXP1阳性和nNOS阳性神经元比例以占HuC/HuD阳性神经元总数的百分比计算。
三、研究结果
3.1 FOXP1和nNOS在啮齿类STN中呈分区表达，但在人类STN中不分区
免疫荧光染色显示，FOXP1阳性和nNOS阳性神经元群体在三种物种和三个STN区域中呈现不同的空间分布。在小鼠STN中，FOXP1和nNOS群体明显分离且几乎不重叠：FOXP1神经元局限于STN的腹外侧部，nNOS神经元局限于背内侧部，共表达两种标志物的神经元仅占很小比例。在大鼠中，表达模式与小鼠相似但存在差异：FOXP1阳性群体仍局限于腹外侧STN，nNOS阳性群体主要位于背外侧STN，但nNOS表达延伸至STN腹侧部分，部分FOXP1阳性神经元共表达nNOS；FOXP1/nNOS双阳性群体在大鼠中大于小鼠，主要位于以FOXP1阳性神经元为主的腹内侧区。在人类STN中，这两类神经元群体不呈现空间限制性表达模式，FOXP1阳性和nNOS阳性神经元弥漫性混合并均匀分布于整个核团，共定位程度较高，FOXP1/nNOS双阳性神经元是重要亚群且同样弥散分布。
3.2 人类STN神经元中nNOS阳性亚群显著扩张
定量分析显示，FOXP1阳性神经元在三种物种中均占STN神经元总数的40%–45%（小鼠41.2%，大鼠46.5%，人类41.4%），比例相当稳定。而nNOS阳性神经元比例呈现较大的物种间差异：小鼠为31.9%，大鼠为42.6%，人类高达67.8%。随着nNOS阳性比例从啮齿类到人类的递增，FOXP1/nNOS共定位比例也随之升高：双阳性神经元占所有神经元的比例在小鼠为6.7%，大鼠为19.5%，人类为30.3%。FOXP1阴性/nNOS阳性神经元比例在小鼠中最小（25.2%），在人类中最大（37.5%）；反之，FOXP1阳性/nNOS阴性神经元比例在小鼠中最大（34.5%），在人类中最小（11.1%）。神经元密度方面，小鼠STN神经元密度最大，其次为大鼠，人类最小。
3.3 FOXP1和nNOS在STN内均呈现前后表达梯度
按STN前后位置分组分析发现，FOXP1和nNOS均呈现区域性的阳性神经元比例变化，且每种物种具有特异性的前后表达模式。小鼠中FOXP1阳性神经元比例在 posterior 部最高（57.2%），前部次之（39.2%），中央最低（27.2%）；大鼠中FOXP1阳性比例从前向后递增（前部36.3%，中央48.4%，后部54.8%）；人类中FOXP1阳性比例在前部最高（47.8%），中央和后部大致相当（36.8%和39.6%）。nNOS方面，小鼠前部比例最低（26.2%），中央和后部约三分之一（34.9%和34.3%）；大鼠前部最高（47.7%），中央和后部相近（38.3%和41.9%）；人类呈现明显的前后梯度，前部最高（76.9%），中央次之（69.2%），后部最低（57.4%）。FOXP1/nNOS双阳性亚群的变化趋势与上述一致：小鼠和大鼠均在 posterior 部比例最高，而人类在前部最高（39.7%），中央29.8%，后部21.5%。人类STN前部FOXP1阴性/nNOS阴性（仅HuC/HuD阳性）神经元比例最小（14.9%），中央和后部与啮齿类大致相当。这些数据表明，人类STN中nNOS阳性群体的扩张主要发生在前部和中央区域，源于原先FOXP1和nNOS双阴性的神经元获得nNOS表达，以及部分FOXP1阳性神经元获得nNOS表达。
四、讨论与结论
本研究提供了多项新发现：首次证实FOXP1蛋白在成年大鼠和人类STN中表达，同时确认了小鼠STN中的表达；揭示FOXP1阳性和nNOS阳性神经元亚群在啮齿类STN中空间分离，而在人类STN中弥漫混合均匀分布；发现人类STN中nNOS阳性和FOXP1/nNOS双阳性亚群较啮齿类显著扩张。FOXP1阳性神经元约占成年哺乳动物STN神经元的40%，是一个重要的神经元亚群。结合既往研究，小鼠STN投射至纹状体小清蛋白（parvalbumin）阳性中间神经元的逆行标记神经元主要位于腹内侧部，与本研究中小鼠FOXP1阳性群体空间位置对应，提示FOXP1可能在STN正常功能中发挥重要作用。nNOS阳性神经元在人类STN中约占68%，显著高于小鼠（约32%）和大鼠（约43%），但低于既往文献报道的90%–95%，这一差异可能源于方法学不同：既往研究使用Nissl染色计数总神经元，而本研究使用HuC/HuD作为泛神经元标志物进行同一切片上的双标共定位，且既往研究使用方格抽样法可能引入误差。关于STN的三分模型（背外侧运动区、腹内侧联合区、内侧边缘尖端），本研究结果不支持人类STN存在基于FOXP1和nNOS的清晰亚区划分，而支持对三分模型进行修订的观点；但在啮齿类中，FOXP1和nNOS的分布可将STN分为两个区域：富含nNOS阳性群体的背内侧部和富含FOXP1阳性群体的腹外侧部。结合既往研究，nNOS可能标记投射至腹侧苍白球的神经元，FOXP1则特征性表达于投射至背内侧苍白球及纹状体小清蛋白阳性中间神经元的神经元群体。研究的主要局限性在于啮齿类与人类样本组织质量的显著差异，人类样本的死后间隔（postmortem interval，PMI）可能影响结果。研究结论指出，本研究首次提供了FOXP1蛋白在成年大鼠和人类STN中表达的证据，确认了小鼠STN中的FOXP1表达及所有物种中明确的nNOS表达；啮齿类STN显示背腹侧模式化分布，可划分为两个区域，而人类STN显示均匀分布的混合神经元群体，无明确亚区；由于人类/灵长类STN的细胞构筑分区组织远不如啮齿类严格，将啮齿类数据转化应用于临床相关问题时需保持审慎。
