《Journal of Neurochemistry》：Examining the Impact of Neurodevelopmental Nicotine Exposure on Cortical Excitation/Inhibition Homeostasis Markers in a Cerebral Organoid Model of Schizophrenia
论文摘要专业翻译
精神分裂症（Schizophrenia, SCZ）是一种严重的神经精神疾病，被认为源于遗传易感性与环境风险因素（包括产前尼古丁暴露，prenatal nicotine exposure, PNE）之间的相互作用。尽管PNE已被认为与SCZ风险增加相关，但其潜在机制仍不清楚。SCZ与PNE均已被独立地与兴奋/抑制（excitation/inhibition, E/I）失衡相关联，提示PNE可能加剧与SCZ相关的神经发育紊乱。本研究采用源自人诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）的大脑类器官模型，探讨PNE对SCZ中E/I相关通路的影响。研究人员对类器官进行慢性尼古丁暴露，并通过免疫荧光（immunofluorescence, IF）和定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction, qPCR）进行分析。结果显示，SCZ与对照类器官在神经祖细胞标志物及多种GABA能、谷氨酸能和胆碱能标志物上存在疾病相关差异。具体而言，SCZ来源类器官表现出SOX2及GABA能分化与合成标志物（LHX6、GAD1/GAD67和SST）表达降低，部分GABA能和谷氨酸能标志物（GABRA1、GABRA2、GABBR2和GRIA1）表达升高，以及多种胆碱能合成、降解和受体标志物的改变。尼古丁的作用较为温和，且仅限于CCK、SLC6A1和SST。这些发现支持E/I失衡在SCZ病理生理学中的作用，并为早期生活暴露如何影响疾病风险提供了见解。
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一、研究背景与问题提出
精神分裂症（Schizophrenia, SCZ）是一种影响全球约1%人口的严重神经精神疾病，以感知、认知和情感方面的深刻紊乱为特征。尽管抗精神病药物对幻觉、妄想等阳性症状常有效，但阴性症状和认知缺陷的治疗仍不充分。SCZ被认为源于遗传易感性与环境风险因素的共同作用。全基因组关联研究（Genome-wide association study, GWAS）已鉴定出100多个风险位点，涉及突触传递、钙信号和谷氨酸能神经传递相关基因，如GRIN2A、GRIA1和GRM3。然而，常见变异仅解释部分遗传度，提示罕见拷贝数变异（copy number variation, CNV）也参与其中。
仅遗传风险不足以导致SCZ。产前感染、母体应激、缺氧及物质暴露（如尼古丁、大麻）等环境因素与SCZ发生持续相关。神经发育假说（neurodevelopmental hypothesis, NDH）提出，SCZ源于基因×环境（gene-environment interaction, GxE）相互作用导致的早期脑发育紊乱，进而引起多巴胺能、GABA能和谷氨酸能环路异常。“二次打击假说”进一步认为，遗传脆弱性作为第一次打击，增加发育中大脑对第二次打击（如环境应激源）的敏感性。
产前尼古丁暴露（prenatal nicotine exposure, PNE）是重要的环境因素之一。流行病学研究表明，PNE与注意缺陷/多动障碍、孤独症谱系障碍及SCZ等不良神经发育结局相关。荟萃分析显示，妊娠期重度吸烟母亲的后代SCZ风险增加25%–40%。尼古丁通过结合烟碱型乙酰胆碱受体（nicotinic acetylcholine receptor, nAChR）发挥作用，这些受体从妊娠早期即在发育脑中广泛表达，调节神经元增殖、迁移、突触形成及谷氨酸、GABA和多巴胺等关键神经递质的释放。啮齿动物PNE模型显示AMPA受体表达升高、谷氨酸能张力增强及小白蛋白（parvalbumin, PV）中间神经元发育受损，均汇聚于皮层兴奋/抑制（excitation/inhibition, E/I）失衡——这是SCZ病理的核心特征。
然而，直接研究人类神经发育机制长期受伦理和技术限制。大脑类器官由人诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell, iPSC）衍生，可在细胞和分子分辨率下部分重现早期脑发育，具有分层皮层结构，包含多种神经和胶质细胞群体，并维持与胚胎脑一致的基因表达模式。SCZ来源类器官已被证明能重现祖细胞增殖减少、神经元过早分化和突触基因表达失调等关键神经发育异常。尽管SCZ和PNE均被独立地与E/I失调相关联，但二者在人类来源系统中的相互作用尚未被系统探索。本研究采用SCZ患者来源的大脑类器官模型，探讨尼古丁暴露对神经元分化和神经递质系统发育的影响。
二、研究目的
本研究旨在利用源自3名对照（CTRL）和3名SCZ供体的iPSC大脑类器官模型，系统考察慢性尼古丁暴露对GABA能、谷氨酸能和胆碱能标志物表达的影响，以揭示SCZ相关遗传背景与PNE在皮层E/I稳态调控中的相互作用。由于SCZ是高度多基因且遗传异质性疾病，本研究所用SCZ类器官代表异质性、疾病相关的遗传背景，而非特定易感变异。
三、主要技术方法
研究人员从美国国家精神卫生研究所（National Institute of Mental Health, NIMH）遗传资源库获得3名对照和3名SCZ供体的iPSC细胞系。采用STEMDiff脑类器官试剂盒，基于Lancaster等人描述的非引导生成方法制备脑类器官。从第15天（D15）开始，类器官接受0（载体）、0.1或1 μmol/L尼古丁处理14天，处理时间对应孕后第7–9周，即皮层板初始形成阶段。低剂量（0.1 μmol/L）反映吸烟妊娠中羊水、胎盘和胎儿血清中的尼古丁浓度，高剂量（1 μmol/L）接近吸烟者血清浓度。D120时收集类器官进行免疫荧光（immunofluorescence, IF）和定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction, qPCR）分析。IF使用共聚焦显微镜成像，通过Fiji ImageJ进行颗粒计数并归一化至DAPI。qPCR以GAPDH和ACTB为内参基因，采用2???Cq方法分析。统计采用双因素方差分析（two-way ANOVA）和Tukey事后检验。
四、研究结果
4.1 神经诱导的确认
通过IF检测SOX2+神经祖细胞和NeuN+成熟神经元，确认所有6个细胞系和所有实验条件下均成功进行神经诱导。双因素ANOVA显示SOX2表达存在疾病主效应（Disease: F(1,30)=6.7250, p=0.0100），主要由载体处理SCZ类器官中SOX2表达低于CTRL类器官驱动（p=0.0500）。NeuN表达无疾病、处理或交互作用的显著主效应。这些发现确认所有组的神经诱导成功，并识别出SCZ来源类器官中SOX2表达降低，而NeuN表达无相应差异。
4.2 SCZ类器官表现出谷氨酸能和GABA能信号标志物的汇聚性紊乱
qPCR分析显示，SCZ类器官中LHX6（Disease: F(1,49)=7.4500, p=0.0090）和GAD1（Disease: F(1,49)=8.2930, p=0.0059）mRNA表达降低，主要由1 μmol/L尼古丁处理组中SCZ类器官LHX6表达低于CTRL（p=0.0300）及0.1 μmol/L尼古丁处理组中GAD1表达低于CTRL（p=0.0154）驱动。GABRA1（Disease: F(1,49)=21.2000, p<0.001）、GABRA2（Disease: F(1,50)=18.34, p<0.001）和GABBR2（Disease: F(1,50)=6.8060, p=0.0100）mRNA表达存在疾病主效应，SCZ类器官中GABRA1和GABRA2表达显著高于CTRL类器官。谷氨酸能标志物中，GRIA1（Disease: F(1,51)=114.7000, p<0.001）和SLC17A7（Disease: F(1,50)=8.5840, p=0.0050）mRNA表达存在疾病主效应，SCZ类器官中GRIA1表达在所有三个处理组中均显著高于CTRL（p<0.001）。CCK表达存在处理主效应（Treatment: F(2,46)=5.9300, p=0.0050），0.1 μmol/L尼古丁处理的CTRL类器官CCK mRNA表达显著高于载体（p=0.0060）和1 μmol/L处理组（p=0.0100）。SLC6A1表达存在疾病×处理交互作用（Interaction: F(2,50)=4.0790, p=0.0200），1 μmol/L尼古丁处理的CTRL类器官SLC6A1表达显著高于载体处理（p=0.0020）及相同处理的SCZ类器官（p=0.0100）。
IF分析显示，GAD67蛋白表达存在疾病主效应（Disease: F(1,30)=10.6600, p=0.0030），载体处理SCZ类器官中GAD67表达显著低于CTRL（p=0.0300）。SST蛋白表达存在疾病主效应（Disease: F(1,30)=26.6000, p<0.001）和处理主效应（Treatment: F(2,30)=5.2700, p=0.0100），CTRL类器官中SST表达在所有三个处理组中均高于SCZ类器官（p=0.0020, p=0.0060, p=0.0100），且1 μmol/L尼古丁处理的SCZ类器官SST表达高于载体处理（p=0.0100）。PV蛋白表达无显著差异。
4.3 SCZ类器官表现出胆碱能信号系统的改变
qPCR分析显示，SLC5A7（Disease: F(1,50)=4.4150, p=0.0400）和CHAT（Disease: F(1,50)=4.6690, p=0.0400）mRNA表达存在疾病主效应，主要由1 μmol/L尼古丁处理组中SCZ类器官表达低于CTRL驱动（p=0.0200和p=0.0100）。ACHE表达存在疾病主效应（Disease: F(1,50)=16.9800, p<0.001），载体（p=0.0070）和0.1 μmol/L（p=0.0090）处理组中SCZ类器官ACHE表达显著高于CTRL。CHRNA4（Disease: F(1,49)=41.7200, p<0.001）和CHRNA7（Disease: F(1,48)=6.5460, p=0.0137）mRNA表达存在疾病主效应，SCZ类器官CHRNA4表达在所有处理组中均高于CTRL（p<0.001, p<0.001, p=0.005）。SLC18A3和CHRNB2表达无显著差异。
IF分析显示，nAChR α4（Disease: F(1,30)=47.0000, p<0.001）、α7（Disease: F(1,30)=6.7450, p=0.0100）和β2（Disease: F(1,30)=28.8300, p<0.001）亚基蛋白表达均存在疾病主效应。SCZ类器官中α4和β2亚基蛋白表达在所有处理组中均低于CTRL（α4: p<0.001, p=0.0200, p<0.001；β2: p<0.001, p=0.0200, p=0.0090），α7亚基蛋白表达在1 μmol/L处理组中低于CTRL（p=0.0300）。
五、讨论与结论
本研究发现SCZ来源类器官在GABA能、谷氨酸能和胆碱能系统中表现出内在的分子和细胞改变，与SCZ病理生理学的核心特征一致。SCZ类器官中SOX2+神经祖细胞表达降低，提示祖细胞维持或增殖受损，而非整体神经分化障碍。SOX2+细胞定位于皮层板外周，可能反映类器官缺乏血管网络，限制了空间保真度和层状组织解释。
在E/I平衡标志物方面，GAD67在mRNA和蛋白水平均降低，可能削弱抑制性张力。LHX6表达降低可能干扰PV+和SST+中间神经元从内侧神经节隆起向皮层的迁移及GABA能表型获得。SST蛋白表达降低与死后脑研究一致。GABRA1、GABRA2和GABBR2表达升高可能是对GABA能信号减弱的代偿反应。谷氨酸能方面，SLC17A7和GRIA1表达升高可能反映谷氨酸包装和释放增加，作为对抑制性张力降低的代偿。
胆碱能系统中，SLC5A7和CHAT表达降低、ACHE表达升高，共同提示乙酰胆碱合成减少和降解增加。nAChR α4、α7和β2亚基蛋白表达降低，与文献中SCZ患者受体水平降低的报道一致。α4亚基mRNA升高但蛋白降低，提示转录后调控。
尼古丁处理效应相对温和，仅CCK和SLC6A1受显著影响。CCK在0.1 μmol/L尼古丁处理的CTRL类器官中表达升高。SLC6A1在1 μmol/L尼古丁处理的CTRL类器官中表达升高，但SCZ类器官中未见此效应，提示SCZ类器官对尼古丁反应性减弱，可能与nAChR表达降低有关。
研究结论：SCZ来源脑类器官表现出GABA能、谷氨酸能和胆碱能系统的广泛内在改变，支持E/I失衡在SCZ病理生理学中的作用。尼古丁暴露效应较为温和且靶点特异，提示疾病遗传背景对早期神经发育轨迹的影响强于尼古丁暴露，而尼古丁可能作为调节因子而非E/I失调的主要驱动因素。这些发现为理解早期生活暴露如何影响SCZ疾病风险提供了见解。
