《Journal of Neuroendocrinology》：Arcuate kisspeptin neurons display two types of calcium events: Regulation by sex, gonads, and senktide
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促性腺激素释放激素（gonadotropin-releasing hormone，GnRH）的释放模式控制着脊椎动物的生殖功能，并受到性腺反馈的调节。越来越多的证据表明，对类固醇敏感的下丘脑弓状核kisspeptin–神经激肽B–强啡肽（KNDy）神经元驱
促性腺激素释放激素（gonadotropin-releasing hormone，GnRH）的释放模式控制着脊椎动物的生殖功能，并受到性腺反馈的调节。越来越多的证据表明，对类固醇敏感的下丘脑弓状核kisspeptin–神经激肽B–强啡肽（KNDy）神经元驱动GnRH脉冲。KNDy神经元在体内表现出与LH脉冲之前相协调的大幅度钙信号；在这些细胞的脑片记录中，协调事件持续存在。研究人员使用cre-lox技术将GCaMP6f表达靶向至KNDy神经元。研究人员进行了脑片钙成像以识别假定的单位钙事件。新设计的分析在完整和性腺切除的成年雄性和雌性小鼠中鉴定出两种类型的钙事件（快事件和慢事件）。神经激肽B和神经激肽-3受体激动剂senktide是KNDy神经元动作电位放电的强激活剂。研究人员测定了senktide在5分钟基线和处理期间对钙事件的影响。性腺切除出乎意料地增加了GCaMP6f荧光；研究人员调整了光照水平以使初始水平标准化。Senktide增加了快事件和慢事件的频率；在性腺切除小鼠中，这种效应在快事件上有所增强。Senktide仅在性腺切除小鼠中增加了快事件的幅度。相比之下，对于慢事件，senktide在所有组中均增加了幅度，且性腺切除小鼠的增幅大于完整小鼠。性腺切除和senktide对快事件与慢事件的差异性调控表明这两种事件存在两种不同的机制，这些机制也可能不同于在体内KNDy神经元中观察到的大幅度事件。
## 论文解读
### 研究背景
促性腺激素释放激素（gonadotropin-releasing hormone，GnRH）神经元构成脊椎动物生殖调控的最终共同中枢通路。GnRH以脉冲方式分泌，这种脉冲式释放对垂体功能至关重要，脉冲频率的变化是驱动雌性生殖周期中促黄体生成素（luteinizing hormone，LH）和促卵泡激素（follicle-stimulating hormone，FSH）差异性释放的关键。然而，脉冲发生器的本质以及类固醇反馈如何改变脉冲频率一直是长期未解的问题。已有研究表明，共表达kisspeptin、神经激肽B和强啡肽的弓状核KNDy神经元是类固醇反馈和脉冲发生的重要候选神经元。在体光纤记录研究显示，表达GCaMP6s的KNDy神经元群体水平钙事件先于LH脉冲出现；脑片制备中这些神经元的同步化钙事件（微型SE）持续存在并与动作电位爆发相关。既往研究多采用GCaMP6s和较低采样率，其较慢的动力学特性限制了对单个动作电位来源钙事件的分辨。本研究采用动力学更快的GCaMP6f和更高采样率，系统探究KNDy神经元钙事件的类型及其受性别、性腺状态和神经调节物质的影响。
### 研究内容
研究人员将Tg(Kiss1-cre)J2-4Cfe/J小鼠与B6;129S-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAG-GCaMP6f)Hze/J小鼠杂交，使KNDy神经元特异性表达GCaMP6f。实验对象包括间情期雌性、去卵巢（OVX）雌性、完整雄性和去势（ORX）雄性四组成年小鼠，在手术5–19天后制备含弓状核的急性下丘脑脑片（300 μm），以10 Hz采样率进行钙成像。记录5分钟基线后，浴槽给予神经激肽-3受体激动剂senktide（100 nM）处理5分钟。
### 关键技术方法
研究人员采用cre-lox系统将GCaMP6f靶向表达于KNDy神经元；使用NoRMCorre算法进行运动校正；通过半自动算法选择感兴趣区域（regions of interest，ROIs）并构建八边形半影区进行离焦光减除；自主研发了基于Student's t-test的事件检测算法"Custard"，并利用0.2 Hz低通滤波分离慢事件；采用线性混合模型（linear mixed model，LMM）进行统计分析，以切片和动物为随机效应。
### 研究结果
**性腺切除影响GCaMP6f荧光水平。** 在实验中发现，完整小鼠的基线荧光直方图峰值仅为相机动态范围的10%–20%，而去势小鼠的荧光分布更高。研究人员调整光照强度使各组90%像素荧光强度低于20,000以避免饱和，去势小鼠光照强度为5%–30%而完整小鼠为90%–100%。Western blot分析排除了GCaMP6f表达水平的差异，提示性腺反馈可能改变KNDy神经元的钙稳态。
**KNDy神经元表现出两种时间尺度的钙事件。** 通过Custard算法和低通滤波结合的事件检测方法，研究人员在原始ΔF/F0轨迹中鉴定出两类钙事件：快事件具有快速上升和接近单位钙信号的衰减速率，类似单动作电位诱发的GCaMP6f钙信号；慢事件频率较低、幅度更大、时程更长。半影减除处理后的数据验证了这些事件主要来源于所选ROI而非离焦光干扰。
**性别、性腺状态和senktide对钙事件频率和幅度的影响。** 线性混合模型分析显示，快事件频率受性别、性腺状态和senktide三者交互作用影响。Senktide增加所有组快事件频率，去势进一步增强此效应，且雌性增强幅度大于雄性。Senktide仅在去势小鼠中增加快事件幅度。对于慢事件，senktide在四组中均增加频率且程度相似；慢事件幅度在senktide处理后增加，且去势小鼠的增幅显著大于完整小鼠。此外，约10%完整小鼠的ROI在senktide处理期间荧光下降，而去势组ROI表现出更稳健的ΔF/F0变化。
**半影减除数据验证主要结果。** 对半影减除后轨迹的分析显示，与原始ΔF/F0分析相比，事件频率有所降低（因噪声增加），幅度因F0分母减小而增高，但快、慢事件的调节模式与原始数据分析基本一致，确认了研究结果的可靠性。
### 总结与结论
讨论部分指出，既往研究多使用2倍标准差阈值检测大幅度钙事件（如SE和mSE），而本研究所检测的快、慢事件绝大多数低于该阈值，提示它们与体内SE是根本不同的事件类型。研究人员提出假说：快事件可能来自单次动作电位，慢事件可能来自动作电位爆发，而体内SE来自更显著的长时间放电变化。研究还提出未来需探究的问题，包括两类事件与LH脉冲相关SE和脑片mSE的对应关系、senktide是否影响细胞间钙事件协调、以及动作电位放电之外的钙稳态机制对事件的贡献。
研究人员得出结论：本研究确认了KNDy神经元生物学的多个方面，并揭示了钙动态的新特征——快、慢两种钙事件受性别、性腺状态及senktide的差异性调控，提示二者具有不同机制。这些发现为深入理解钙动态如何参与GnRH脉冲发生及类固醇反馈调控脉冲频率提供了新的研究方向，对于最终阐明GnRH脉冲发生器的神经机制具有重要意义。
