SGIP1在脊髓伤害性突触中限制大麻素受体信号并调节神经炎症期间的镇痛作用

《The Journal of Physiology》：SGIP1 limits cannabinoid receptor signalling in spinal nociceptive synapses and modulates analgesia during neuroinflammation

　　

摘要专业翻译 内源性大麻素系统在疼痛调节中发挥重要作用，但其在镇痛中的应用受到大麻素疗效有限及副作用多的限制。脊髓背角中的大麻素受体1（CB1）对伤害性神经传递提供突触前抑制。CB1调节蛋白——含SH3结构域的GRB2样蛋白3相互作用蛋白1（SGIP1）控制其功能可用性，而其在疼痛调节中的作用仍知之甚少。研究人员通过行为学测试、脊髓切片膜片钳记录及背根神经节（DRG）神经元钙成像，检测了SGIP1在对照及炎症条件下对伤害性信号传导的作用。两性SGIP1敲除（KO）小鼠均表现出选择性热敏感性降低，而机械 withdrawal 阈值无变化。在卡拉胶诱导炎症后，野生型（WT）和KO小鼠均出现机械性痛觉过敏，而KO小鼠的热痛觉过敏仅达到WT小鼠的对照值。鞘内应用大麻素激动剂WIN55,212-2在WT和KO小鼠中均产生镇痛作用，且在KO动物中低剂量（5 μg对比10 μg）效果增强。在炎症SGIP1 KO小鼠的切片中，WIN55,212-2（1 μM）诱导微小兴奋性突触后电流（mEPSC）频率显著更大程度地降低，而幅度无变化，表明KO小鼠突触前抑制增强。KO小鼠炎症后WIN55,212-2的这些增强抑制作用在DRG培养神经元中得到进一步证实。研究结果确立SGIP1作为CB1功能的状态依赖性负调节因子，并确定SGIP1–CB1相互作用作为在炎症性疼痛条件下选择性增强大麻素镇痛的候选靶点。

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一、研究背景与科学问题

慢性疼痛源于伤害性通路中的适应不良可塑性，涉及外周伤害性感受器、脊髓环路和超脊髓系统的动态相互作用。脊髓背角是伤害性处理的第一中枢中继站点，外周组织炎症驱动初级传入神经元的外周敏化和背角神经元的中枢敏化，表现为痛觉过敏和痛觉超敏。内源性大麻素系统是疼痛处理的关键调节系统，大麻素受体1（CB₁）主要通过突触前抑制兴奋性神经递质释放介导抗伤害性信号传导。CB₁受体激活通过Gi/o介导的信号通路抑制电压门控钙通道（VGCCs）并激活内向整流钾通道。然而，尽管已鉴定出中枢敏化的众多机制，炎症性疼痛期间调节大麻素受体功能的调控机制仍未得到充分表征。

近期研究鉴定SGIP1为CB₁受体功能的调节因子。SGIP1在神经系统中大量表达，与CB₁受体在轴突和突触前末梢共定位。SGIP1损害激动剂诱导的CB₁内化，从而调节受体运输、表面定位和下游信号传导。SGIP1与CB₁胞内C末端α螺旋H9结构域的结合促进轴突CB₁表面表达。SGIP1基因缺失小鼠减少焦虑样行为和急性伤害性感受，并增强对四氢大麻酚（THC）和吗啡的反应性。然而，SGIP1在炎症性和慢性疼痛状态中的精确作用仍不清楚，SGIP1缺失对脊髓背角CB₁介导突触前抑制的功能后果尚未被直接检验。此外，内源性大麻素系统在受体表达、内源性大麻素张力和对大麻素干预反应方面表现出性别二态性，提示需要检验SGIP1对伤害性调节的潜在性别特异性贡献。

基于上述背景，本研究整合行为学检测、脊髓切片膜片钳电生理和DRG神经元钙成像，在SGIP1野生型（WT）和敲除（KO）小鼠中研究SGIP1在伤害性处理和炎症性疼痛中的作用。研究假设SGIP1缺失将调节大麻素受体介导的突触前抑制并增强大麻素激动剂的镇痛效果，尤其是在炎症条件下。

二、主要技术方法

研究人员采用了以下关键技术手段：行为学测试包括电子von Frey测试评估机械 withdrawal 阈值、热板测试（53°C）评估热伤害性感受、Librae负重测试仪评估静态负重；急性脊髓切片制备后进行全细胞膜片钳记录，记录浅表背角神经元（I层和II_外侧层）中AMPA受体介导的微小兴奋性突触后电流（mEPSC）；DRG神经元原代培养后进行Fura-2 AM钙成像，检测高钾去极化诱发的钙瞬变。炎症模型采用卡拉胶足底皮下注射（体内）和脂多糖（LPS）预处理DRG培养（体外）。实验动物为成年SGIP1 WT和KO小鼠，由捷克科学院分子遗传学研究所Jaroslav Blahos教授提供。

三、研究结果

SGIP1缺失在两种性别中降低热敏感性而不改变机械敏感性。 通过von Frey和热板测试评估雄性和雌性SGIP1 WT和KO小鼠的机械和热刺激敏感性。两种性别的WT和KO小鼠之间机械刺激的PWT无显著差异。相反，两种性别的SGIP1 KO小鼠对热的伤害性反应潜伏期显著增加（雄性P<0.0001；雌性P<0.0001），表明SGIP1缺失选择性降低热敏感性，与性别无关。

卡拉胶诱导的机械性痛觉过敏和相对热痛觉过敏在SGIP1 WT和KO小鼠中相当。 卡拉胶皮下注射后，两种基因型的雄性和雌性小鼠同侧发炎爪均出现显著的PWT降低，表明机械性痛觉过敏发展，且WT和KO之间程度相当。热板反应潜伏期在两种基因型中均降低，但SGIP1 KO小鼠在整个实验过程中维持更高的绝对热板反应潜伏期。归一化数据显示两种基因型之间卡拉胶诱导的热痛觉过敏相对程度相当，表明SGIP1 KO小鼠即使在炎症条件下整体热敏感性仍显著降低。

鞘内WIN55,212-2（10 μg）在SGIP1 WT和KO小鼠中相当地减轻卡拉胶诱导的机械性痛觉过敏、热痛觉过敏和负重受损。 单次鞘内注射大麻素受体激动剂WIN55,212-2（10 μg/5 μl）在两种基因型的雄性和雌性小鼠中均显著逆转卡拉胶诱导的机械性痛觉过敏、热痛觉过敏和负重降低，WT和KO之间无显著基因型依赖性差异。

低剂量鞘内WIN55,212-2（5 μg）在雄性SGIP1 WT和KO小鼠中相当地减轻卡拉胶诱导的疼痛样行为。 在雄性小鼠中，5 μg剂量的WIN55,212-2在两种基因型中均有效逆转机械性痛觉过敏、热痛觉过敏和负重受损，WT和KO之间无显著差异。

SGIP1 KO小鼠在炎症条件下对低剂量WIN55,212-2（5 μg，鞘内）表现出更强的行为反应性。 在SGIP1 WT小鼠中，5 μg和10 μg两种剂量对机械性痛觉过敏和热痛觉过敏的逆转效果相当。然而，在SGIP1 KO小鼠中，5 μg剂量产生的机械性痛觉过敏逆转显著大于10 μg剂量（1 h和3 h时间点P分别为0.0401和0.00253），热板反应潜伏期增加也显著更大（P分别为0.0107和0.00541），表明KO小鼠对低剂量表现出增强的反应性。

SGIP1缺失在炎症条件下增强WIN55,212-2诱导的兴奋性突触传递抑制。 在对照条件下，SGIP1 WT和KO小鼠之间基础sEPSC和mEPSC频率及幅度无显著差异。WIN55,212-2（1 μM，12 min）在两种基因型中均显著降低mEPSC频率，无基因型差异。然而，在卡拉胶诱导外周炎症后，WIN55,212-2在SGIP1 KO神经元中诱导的mEPSC频率抑制显著大于WT神经元（基因型效应P=0.00595；交互作用P=0.00520），而mEPSC幅度在所有条件下均保持不变，表明突触前作用位点。

LPS预处理在SGIP1 WT和KO小鼠DRG神经元中放大WIN55,212-2对钾诱导去极化钙反应的抑制。 在WT和KO DRG神经元中，LPS单独处理不改变钾诱发的钙反应。WIN55,212-2（100 nM）应用产生进行性抑制，LPS预处理显著增强这种抑制。在两种基因型中，LPS预处理后WIN55,212-2的抑制作用均显著大于单独WIN55,212-2应用。

WIN55,212-2的抑制效果在DRG神经元中被SGIP1缺失和炎症加性增强。 在对照条件下，WIN55,212-2在KO神经元中诱导的钾诱发反应抑制显著大于WT神经元。在LPS炎症条件下，KO神经元的抑制进一步增强，在4、6和10 min时间点达到统计学显著，表明SGIP1缺失和炎症启动对大麻素受体介导的去极化诱发钙反应抑制具有加性效应。

四、讨论与结论

本研究确立了SGIP1作为伤害性信号传导和内源性大麻素通路在神经炎症期间的调节因子。SGIP1缺失导致与性别无关的热敏感性降低，而机械敏感性不变。在炎症条件下，SGIP1似乎限制DRG神经元和脊髓伤害性突触中的大麻素反应性。电生理记录显示，在炎症条件下SGIP1 KO小鼠中WIN55,212-2对mEPSC频率的抑制显著增强，而对照条件下无基因型差异。钙成像进一步证实SGIP1缺陷神经元中WIN55,212-2诱导的钾诱发钙瞬变抑制更强，且LPS预处理放大此效应。

SGIP1对基础热表型的作用可能涉及CB₁-TRPV1串扰，但确切的作用位点（外周、脊髓或超脊髓）尚需位点特异性操作确定。SGIP1缺失不改变炎症诱导的痛觉过敏和痛觉超敏的发展，表明核心炎症疼痛信号通路在SGIP1缺失时功能保留。SGIP1 KO小鼠对低剂量WIN55,212-2的增强反应性可能与大麻素受体运输或脱敏的改变有关，但受体运输和下游信号传导未在本研究中直接评估。综合来看，研究结果支持SGIP1作为CB₁受体功能的负调节因子，在神经炎症期间限制大麻素镇痛作用，提示SGIP1–CB₁相互作用值得作为慢性疼痛治疗的潜在靶点进行未来评估。