小鼠心内神经节神经元中TREK通道的鉴定及其兴奋性调控作用研究

《The Journal of Physiology》：Identification of TREK channels in mouse intracardiac ganglion neurons

　　

心内神经系统是由弥漫性神经丛（即所谓的心内神经节（ICG））形成的复杂神经网络。这些神经节局部支配并控制心脏功能，但关于ICG神经元活动如何被调控目前知之甚少。尽管已在心脏组织中鉴定出多种离子电流，但TWIK相关K+（TREK）通道在ICG神经元中的表达和作用仍未被探索。TREK通道属于双孔域钾通道（K2P）家族成员，是神经元静息膜电位和兴奋性的重要调节因子，并具有公认的神经保护功能。在本研究中，研究人员表征了小鼠ICG神经元中存在的多种离子电流，包括河豚毒素（TTX）敏感型Na+电流、延迟整流K+电流、Ca2+依赖性K+电流以及A型、H型和M型电流。值得注意的是，研究人员提供了这些神经元中功能性TREK通道表达的首个证据。研究结果表明，TREK通道有助于ICG神经元的兴奋性控制和细胞稳态维持，凸显了其与心脏生理和疾病相关的潜在重要性。

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一、研究背景与科学问题

心脏功能的调控由自主神经系统（ANS）的交感与副交感分支协同完成，而心内神经系统（ICNS）作为位于心房表面及房室沟（AV groove）区域的弥漫性神经节丛，构成了心脏局部调控的整合中枢。心内神经节（ICG）包含感觉、运动和局部调节神经元，通过释放多种神经递质和神经调质，直接参与心脏传导速度、心肌收缩力和心率的调节。尽管以往研究已在豚鼠和大鼠中描绘了ICG神经元的部分电生理特性及离子通道组成，但不同物种间这些通道的表达是否保守尚不清楚。更重要的是，作为双孔域钾通道（K2P）家族重要成员的TWIK相关K⁺（TREK）通道，包括TREK1、TREK2和TRAAK三个亚型，在中枢、外周和自主神经系统中广泛表达，是神经元静息膜电位（RMP）和兴奋性的关键调控因子，并具有神经保护功能。已有研究提示心脏TREK通道参与心律失常、心房颤动（AF）和长QT综合征等病理过程，且TREK通道可被抗心律失常药物激活。然而，TREK通道在ICG神经元中的表达和功能此前完全未知。因此，开展这项研究旨在系统鉴定小鼠ICG神经元的离子电流组成，并首次探索TREK通道在该神经群体中的表达及其对神经元兴奋性的调控作用。

二、研究内容与主要结论

研究人员成功建立了小鼠ICG神经元的分离与原代培养体系，综合运用组织学染色、免疫组织化学（IHC）、免疫细胞化学、实时荧光定量PCR（RT-qPCR）和膜片钳电生理记录等技术，对ICG神经元的组织学定位、神经化学表型、离子电流组成及TREK通道的功能进行了系统研究。主要结论包括：小鼠ICG位于心房背侧区域及房室沟附近；ICG神经元表达酪氨酸羟化酶（TH）和钙结合蛋白calretinin（CR）；ICG神经元可依据放电模式分为phasic、adapting和tonic三种类型；ICG神经元表达TTX敏感的Na⁺电流、Ca²⁺依赖性K⁺电流、延迟整流K⁺电流、A型电流、H电流和M电流；首次证实ICG神经元功能性表达TREK1、TREK2和TRAAK三种通道，且TREK通道激活可调控phasic和adapting神经元的放电频率和静息膜电位，从而控制神经元兴奋性。

三、主要关键技术方法

研究人员使用CD-1小鼠（30–90日龄，雌雄兼用，来自西班牙维戈大学生物实验中心）作为实验对象。关键技术方法包括：组织学上采用Nissl染色定位ICG，利用免疫组织化学（IHC）和免疫细胞化学检测TH、CR、NeuN及三种TREK通道蛋白（KCNK2、KCNK10、KCNK4）的表达；采用RT-qPCR检测kcnk2、kcnk10、kcnk4基因表达，并以GAPDH为内参，同时检测神经元标志物RbFox3和心肌细胞标志物TnnT2以评估培养纯度；电生理方面采用穿孔膜片钳（perforated patch）全细胞记录模式进行电流钳和电压钳实验，并通过细胞贴附式（cell-attached）单通道记录分析TREK通道的单通道动力学特性。

四、研究结果

1. ICG神经元的组织学定位与神经化学表型

Nissl染色显示小鼠ICG位于房室沟附近及心房脂肪组织中，神经节形态和大小异质，每个神经节含15–60个神经元，神经元胞体大而圆，核直径约15.2 μm，而卫星胶质细胞核较小（约4.83 μm）。免疫荧光结果显示ICG神经元均表达TH，且首次发现部分ICG神经元表达CR，提示这些神经元可能参与胞内Ca²⁺信号和稳态调节。

2. ICG神经元的电生理特性

穿孔膜片钳记录显示ICG神经元静息膜电位（RMP）为?70 ± 1.2 mV，膜电容为33.9 ± 1.4 pF。根据对去极化电流脉冲的放电反应，ICG神经元可分为三种类型：phasic神经元（24%，放电1–3个动作电位（AP））、adapting神经元（66%，最大放电约5.47个AP）和tonic神经元（10%，整个脉冲期间持续放电，最大约42.2个AP）。三种神经元在RMP、电容、AP潜伏期、幅度、时程和AHP（后超极化）方面无显著差异，但tonic神经元的瞬时放电频率显著高于phasic和adapting神经元，且AP阈值显著更低（?38.2 mV vs. ?30.8 mV和?32.7 mV）。

3. 多种离子电流的鉴定

电压钳实验表明，ICG神经元表达TTX敏感的Na⁺电流（I_Na，约1421 pA），该电流可被TTX完全阻断，提示不存在TTX抗性Na⁺通道；同时存在可被CdCl₂阻断的Ca²⁺依赖性K⁺电流（I_KCa，约454.6 pA）。通过双脉冲减法方案，研究人员鉴定出延迟整流K⁺电流（I_KV，约583.5 pA）和A型电流（I_A，约507.4 pA）。此外，通过CsCl和TEA（四乙胺）分别揭示出H电流（I_H，在?100 mV时约23.7 pA）和M电流（I_M，在?30 mV时约108.2 pA），后者为首次在ICG神经元中报道。

4. TREK样电流的存在

在包含多种离子通道阻断剂的cocktail条件下，TREK通道激活剂riluzole可剂量依赖性地诱导外向电流，EC₅₀为126.2 μM，并显著增加膜电导（从4.48 nS增至6.67 nS）。该电流呈现典型的TREK外向整流特性。该riluzole激活电流不被ZnCl₂阻断，但可被广谱K⁺通道阻断剂BaCl₂以及TREK特异性阻断剂fluoxetine和spadin显著抑制，且细胞外酸化可显著降低该电流，提示TREK1样通道可能贡献较大。

5. 三种TREK亚型的表达验证

免疫荧光实验在ICG组织切片和原代培养神经元中均检测到TREK1、TREK2和TRAAK的免疫反应性，且与神经元标志物NeuN共定位。RT-qPCR检测到kcnk2（TREK1）、kcnk10（TREK2）和kcnk4（TRAAK）基因表达，培养物中RbFox3（神经元标志）阳性，而TnnT2（心肌细胞标志）仅在个别样本中检出，表明培养体系以神经元为主。单通道记录在对称K⁺条件下记录了三种通道的I-V关系：TREK1呈外向整流（电导约150.8 pS，占多数），TREK2呈内向整流（电导约125.5 pS），TRAAK无明显整流（电导约117.9 pS）。riluzole可显著增加三种通道的开放概率（NPo），但不改变驻留时间和单通道幅度。

6. TREK通道对神经元兴奋性的调控

应用TREK1/TREK2激活剂BL-1249（10 μM）后，phasic和adapting神经元的静息膜电位显著超极化，放电频率显著降低，同时伴随AHP减小、AP阈值升高、AP幅度和最大复极化速度降低；而tonic神经元的膜电位和放电频率均无明显变化，提示tonic神经元可能对TREK通道调节不敏感。

五、讨论与结论

该研究系统表征了小鼠ICG神经元的组织学定位、神经化学表型和多种离子电流组成，证实了不同物种间ICG神经元离子通道表达的保守性。研究人员首次提供了ICG神经元功能性表达TREK1、TREK2和TRAAK三种通道的多层次证据（免疫荧光、RT-qPCR、全细胞和单通道电生理），并证明TREK通道通过稳定静息膜电位和调控放电阈值参与phasic和adapting神经元的兴奋性控制。鉴于TREK通道与心脏缺血、心律失常、心房颤动和心脏肥大等病理过程密切相关，这些发现提示ICG神经元中的TREK通道可能成为心脏疾病潜在的治疗靶点，对理解心脏局部自主调控的细胞机制具有重要意义。