禾谷镰孢菌主要内切木聚糖酶基因缺失揭示受遗传背景影响的不同毒力表型

《Molecular Plant Pathology》：Deletion of Major Endoxylanase Genes in Fusarium graminearum Uncovers Distinct Virulence Phenotypes Influenced by the Genetic Background

　　

摘要专业翻译 禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum）是小麦赤霉病（Fusarium head blight, FHB）的主要病原菌，其分泌内切木聚糖酶以水解木聚糖——半纤维素的主要组分。此前研究表明，高表达基因FGSG_03624（xylB）的突变体在小麦穗上表现出与野生型（wild-type, WT）相似的发病严重程度。然而，在本研究中，三个独立的FGSG_10999（xylA）基因缺失突变体——该基因为第二个高表达内切木聚糖酶基因——其发病严重程度显著降低。出乎意料的是，在ΔxylB遗传背景下敲除xylA基因所获得的双突变体（ΔΔxylB+A）其毒力与ΔxylB及WT相当。ΔxylA突变体与ΔΔxylB+A突变体在体外生长期间均表现出木聚糖酶活性的显著降低，且ΔxylA与ΔxylB突变体在感染穗中的真菌生物量和脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol, DON）积累均有所下降。与ΔΔxylB+A和ΔxylB不同，ΔxylA在穗部感染期间表现出部分内切木聚糖酶基因和效应蛋白基因的下调。此外，在以小麦穗培养基生长时，与ΔxylB和ΔΔxylB+A的培养滤液相比，ΔxylA的培养滤液在烟草（Nicotiana benthamiana）浸润叶片中表现出总蛋白分泌量的显著减少以及坏死诱导活性的更严重损伤。当在ΔxylA遗传背景下生成xylB缺失突变体时，所得ΔΔxylA+B突变体表现出与亲本ΔxylA相似的严重毒力降低。综上所述，这些结果表明xylA通过非预期的多效性、网络水平改变在禾谷镰孢菌的致病性中发挥关键作用，这一结论亦得到在ΔxylA中互补xylA基因所观察到的部分功能恢复的支持，凸显了遗传背景对表型结果的强烈影响。

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一、研究背景与科学问题

禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum）是小麦赤霉病（FHB）的主要病原菌，该病害导致小麦和大麦严重减产，并造成籽粒被脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）等真菌毒素污染，对人类和动物健康构成威胁。为成功定殖小麦穗部，禾谷镰孢菌分泌多种细胞壁降解酶（CWDEs）、效应蛋白和毒素。植物细胞壁是病原菌入侵的首要屏障，主要由半纤维素、纤维素和果胶等多糖构成。其中，内切木聚糖酶（endoxylanases）通过切割木聚糖主链的β-1,4-糖苷键，在降解半纤维素、促进细胞壁穿透和定殖中发挥重要作用。

禾谷镰孢菌基因组中含有六个在小麦穗部感染期间显著表达的内切木聚糖酶编码基因，其中xylB（FGSG_03624）和xylA（FGSG_10999）均属于GH11家族，具有不依赖催化活性的坏死诱导活性，且在接种后3天表达水平最高。然而，此前的功能研究结果存在矛盾：在PH1背景下敲除xylB的突变体保持完全的野生型毒力，而调控所有木聚糖酶基因表达的转录因子Xyr1缺失突变体同样保持野生型毒力水平，提示广泛的木聚糖酶活性可能并非禾谷镰孢菌毒力所必需。但另一方面，在CS3005背景下敲除xylA基因则导致毒力显著降低、穗部真菌生物量减少以及在含木糖培养基上生长受损，表明该基因在木聚糖利用和致病性中具有重要作用。

这些看似矛盾的发现提出了一个关键科学问题：单个CWDE基因对真菌毒力的贡献是否取决于基因缺失所引入的遗传背景。为解答这一问题，研究人员在ΔxylB遗传背景下构建了xylA缺失的双突变体（ΔΔxylB+A），并将其与亲本ΔxylB及三个在PH1野生型背景下独立构建的ΔxylA单突变体进行系统比较，同时构建了反向双突变体ΔΔxylA+B（在ΔxylA背景下敲除xylB）以及xylA基因的互补菌株，以全面评估遗传背景和基因缺失顺序对表型的影响。

二、主要研究结论与意义

研究结果表明，xylA是禾谷镰孢菌的关键毒力因子，但其对致病性的贡献不能仅归因于酶学活性或坏死诱导活性。xylA缺失突变体在大豆幼苗和小麦穗上均表现出显著降低的毒力、减少的真菌生物量和DON积累，并伴随其他内切木聚糖酶基因和效应蛋白基因的下调以及培养滤液总蛋白分泌量和坏死活性的显著降低。相比之下，xylB缺失突变体虽然保持野生型水平的可见病害症状，但真菌生物量和DON积累显著下降，且触发了包括效应蛋白基因FGSG_01831上调在内的补偿性反应。最关键的是，在ΔxylB背景下敲除xylA所得的双突变体ΔΔxylB+A表现出与ΔxylB和WT相当的毒力，尽管其酶学活性受损明显；而在ΔxylA背景下敲除xylB所得的反向双突变体ΔΔxylA+B则表现出与ΔxylA相似的严重毒力降低。这一结果强调了遗传背景和基因缺失顺序对表型结果的强烈影响，表明xylA的功能可能作为一个调控枢纽，其缺失引发的多效性网络效应——而非单一酶功能的丧失——是导致毒力降低的主要原因。该研究凸显了在多种遗传背景下评估基因功能以及考虑补偿机制和性状间相互依赖性的必要性。

三、主要技术方法概述

研究人员以禾谷镰孢菌PH1菌株为野生型材料，采用split-marker基因替换策略构建xylA基因敲除突变体（获得三个独立ΔxylA单突变体），并在ΔxylB遗传背景下构建ΔΔxylB+A双突变体；利用潮霉素抗性 cassette在ΔxylA_3F背景下构建反向双突变体ΔΔxylA+B；通过共转化xylA基因（含天然启动子和终止子）与潮霉素抗性基因获得互补菌株。突变体经PCR和qPCR验证正确整合及单拷贝插入。研究采用Szécsi液体培养基分别以木聚糖、羧甲基纤维素（CMC）或果胶为唯一碳源进行体外培养，测定总木聚糖酶（DNSA法）、纤维素酶和聚半乳糖醛酸酶（黏度法）活性；在大豆幼苗（rolled-towel法）和小麦品种‘Bobwhite’穗部（花期点接种）进行毒力测定；通过qPCR定量感染穗中真菌生物量（以TRI6基因和植物actin基因为参照），ELISA法测定DON含量；在感染后3天通过RT-qPCR分析六个内切木聚糖酶基因及多个效应蛋白和次生代谢物合成相关基因的表达；以烟草（N. benthamiana）叶片浸润实验评估培养滤液的坏死诱导活性，并用Bradford法测定总蛋白浓度。

四、主要研究结果

4.1 ΔxylA及以ΔxylB为遗传背景的双敲除突变体的构建

通过split-marker基因替换cassette分别在野生型和ΔxylB突变体中敲除xylA基因，获得三个独立的ΔxylA单突变体（ΔxylA_1F、3F、5C）和一个双突变体ΔΔxylB+A。PCR验证表明除ΔxylA_5C在上游区域扩增异常外，其余突变体整合正确；qPCR确认所有突变体均为遗传霉素抗性基因单拷贝插入。

4.2 ΔxylA单突变体与ΔΔxylB+A突变体的体外及体内特征

在完全培养基（CMA）上，ΔxylA_3F和ΔxylA_5C的径向生长显著降低，且ΔxylA突变体表现出独特的亮黄色成熟中心菌落表型，而ΔxylB和ΔΔxylB+A保持野生型的红色素沉着。酶活测定显示，所有ΔxylA突变体和ΔΔxylB+A的总木聚糖酶活性较野生型降低约50%，而ΔxylB无显著变化；纤维素酶活性在所有突变体中均降低，其中ΔΔxylB+A降低最明显（约75%）；聚半乳糖醛酸酶活性无显著差异。毒力测定方面，仅ΔxylA单突变体在大豆幼苗和小麦穗上表现出显著毒力降低（小麦穗部感病小穗数较WT减少75%–94%），而ΔxylB、ΔΔxylB+A和异位插入突变体（ΔΔECT）的毒力与WT相当。感染穗的真菌生物量在所有敲除突变体中均显著降低（ΔxylA约80%、ΔxylB约70%、ΔΔxylB+A约55%），DON含量也大幅下降，其中ΔxylA突变体最低（约6–11 ppm）。

4.3 内切木聚糖酶、分泌效应蛋白及次生代谢物合成相关基因的表达分析

在感染后3天的麦穗中，ΔxylB突变体和ΔΔxylB+A双突变体的六个内切木聚糖酶基因表达水平与WT无显著差异；而ΔxylA突变体表现出FGSG_06445和xylB基因的下调，ΔxylA_1F还表现出FGSG_11304的下调。在效应蛋白基因方面，ΔxylB突变体中FGSG_01831表达上调，而ΔxylA突变体中该基因及FGSG_03600均显著下调，FGSG_10212（cerato-platanin蛋白FgCPP1）也略有下降。次生代谢物合成基因方面，ΔxylA突变体和ΔΔxylB+A中参与金孢菌素（aurofusarin）生物合成的AurJ（FGSG_02326）表达上调，而ΔxylB中无此变化；FGSG_08079（丁烯酸内酯合成相关）和FGSG_06616（β-1,3-葡聚糖酶）在各突变体中的表达变化各异。

4.4 烟草叶片坏死活性测定

以小麦穗培养基获得的培养滤液浸润烟草叶片后，所有突变体滤液的坏死面积均小于WT。其中ΔxylA单突变体滤液的坏死面积最小，较WT减少78%；ΔxylB和ΔΔxylB+A滤液分别减少45%和48%。ΔxylA突变体滤液的总蛋白浓度显著低于WT、ΔxylB和ΔΔxylB+A。所有滤液中DON含量均低于检测限，排除了DON对坏死活性的贡献。

4.5 以ΔxylA为亲本构建双突变体及其毒力测定

为验证基因缺失顺序的影响，研究人员在ΔxylA_3F背景下敲除xylB基因获得ΔΔxylA+B双突变体。该突变体在CMA上表现出与ΔxylA相似的亮黄色菌落表型和更小的径向生长。大豆幼苗毒力测定显示ΔΔxylA+B的毒力与亲本ΔxylA_3F相当，显著低于ΔΔxylB+A和WT；小麦穗部接种实验中，ΔΔxylA+B的感病小穗百分比较WT降低93%，且显著低于ΔxylA_3F单突变体，而ΔΔxylB+A与WT无显著差异。

4.6 xylA基因的遗传互补

将xylA基因（含天然启动子和终止子）重新导入ΔxylA_3F背景获得两个互补菌株C2.1和C3.8，两者xylA基因表达均得到恢复，在CMA上的生长和色素沉着部分恢复至接近WT水平，木聚糖酶活性完全恢复。在小麦穗部接种中，互补菌株表现出介于WT和ΔxylA_3F之间的中间表型（感病小穗较WT减少约50%，而ΔxylA_3F减少约75%），但该恢复未达到统计学显著水平；DON产量在互补菌株中仍严重受损（约7–8 ppm），与ΔxylA_3F（约3 ppm）相似。

五、讨论与结论

讨论部分指出，xylA缺失突变体的毒力缺陷源于多效性网络层面的改变，包括其他内切木聚糖酶基因（尤其是xylB）的下调、两个效应蛋白基因（FGSG_01831和FGSG_03600）的显著抑制以及坏死诱导活性的降低。ΔΔxylB+A双突变体尽管酶学活性受损明显，却保持较高的坏死活性和毒力，进一步支持酶学活性本身并非xylA的关键毒力决定因素，而是其在野生型遗传背景中缺失所引发的网络级联效应导致了毒力降低。xylB缺失导致的补偿性反应（如FGSG_01831上调）可能解释了ΔxylB及ΔΔxylB+A维持感染能力的原因。反向双突变体ΔΔxylA+B的严重毒力降低表明，一旦xylA被移除，xylB的缺失不再触发明显的补偿机制。互补菌株仅部分恢复毒力且DON产量仍严重受损，提示xylA缺失后建立了持续性的多效性改变。

研究结论表明，xylA是禾谷镰孢菌的关键毒力因子，但其对致病性的贡献不能仅归因于酶学或坏死诱导活性，该基因更像一个调控枢纽，其表型结果源于背景依赖性的相互作用而非单一功能的丧失。此外，xylB基因并非对寄主定殖完全可有可无，其缺失导致真菌生物量和DON积累显著降低，尽管可见病害症状未相应减少，这可能反映了穗部漂白不仅由真菌生物量决定，还受寄主生理反应（如维管阻塞导致的水分运输障碍）影响。该研究强调，在研究致病性因子时需要评估多种遗传背景下的基因功能，并考虑可能的补偿机制和相互依赖性状。