《Journal of Virological Methods》：Empirical substitution models of evolution for protein phylogenetics of the Crimean-Congo hemorrhagic fever virus
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克里米亚-刚果出血热病毒（CCHFV）蛋白质进化的经验替代模型对于概率性系统发育分析至关重要，包括系统发育树重建和祖先序列推断、未来进化轨迹预测、进化参数估计以及选择与分子适应性检测等应用。在蛋白质水平上，经验替代模型描述了氨基酸替换的相对速率和平衡状态下的氨
克里米亚-刚果出血热病毒（CCHFV）蛋白质进化的经验替代模型对于概率性系统发育分析至关重要，包括系统发育树重建和祖先序列推断、未来进化轨迹预测、进化参数估计以及选择与分子适应性检测等应用。在蛋白质水平上，经验替代模型描述了氨基酸替换的相对速率和平衡状态下的氨基酸频率，因其在最大似然函数中的简便实现而被广泛用于概率性系统发育方法。然而，目前可用的蛋白质进化经验替代模型数量有限，仅有约一百种，且某些分类群仍未被充分代表或完全缺失。例如，尽管病毒种类多样且进化动态各异，但专门针对病毒蛋白质开发的经验替代模型寥寥无几，仅包括HIV-1、流感病毒、登革热病毒和黄病毒的少数模型。CCHFV是一种分节段的负义单链RNA病毒，其基因组包含小（S）、中（M）和大（L）三个片段，分别编码核蛋白（NP）、糖蛋白前体（GPC）和RNA依赖性RNA聚合酶（RdRP）。截至目前，尚未有针对CCHFV蛋白质开发的经验替代模型。鉴于CCHFV具有中等进化速率、不断扩大的地理分布以及导致人类严重疾病的特点，且目前尚无特异性抗病毒疗法，研究人员在此推断并评估了CCHFV三个基因组片段所编码蛋白质的经验替代模型。研究人员从NCBI数据库检索了所有编码NP、GPC和RdRP的CCHFV核苷酸序列，经筛选后最终数据集分别包含657、173和438条序列。对于每种蛋白质，研究人员将序列随机分为包含90%序列的方法数据集和包含10%序列的测试数据集，利用QMaker通过最大似然法推断氨基酸对之间的相对替换率矩阵（20×20）和平衡状态下的氨基酸频率，从而得到交换性矩阵，并将所得模型命名为CCHFVnp、CCHFVgpc和CCHFVrdrp。这些模型已被存入EModelDB公共数据库。研究人员还评估了地理采样对替换模式的影响，发现不同地理区域（非洲、亚洲和欧洲）样本的交换性矩阵高度相似。通过比较模型对测试数据集的拟合效果，基于贝叶斯信息准则（BIC）和赤池信息准则（AIC），CCHFV模型在所有现有经验替代模型中表现最佳，其中黄病毒（FLAVI）模型是次优选择。在考虑位点间速率异质性（+I、+G、+R）后，结果依然一致。聚类分析显示，CCHFV模型与其他病毒特异性经验模型（如FLAVI和HIV模型）聚为一类。研究表明，CCHFV模型的氨基酸替换总体上保留了理化性质，但CCHFVgpc模型表现出独特的替换模式，如丝氨酸-脯氨酸、脯氨酸-亮氨酸和甲硫氨酸-苏氨酸的高替换率，以及半胱氨酸频率显著高于其他模型，这反映了表面糖蛋白与内部蛋白质不同的进化约束。总之，这些蛋白质特异性经验模型比通用模型更准确，有助于提高CCHFV系统发育推断的精度，并为理解病毒进化机制和治疗设计提供支持。
研究背景与现存问题
分子进化的替代模型是概率性系统发育分析的基础，广泛应用于系统发育树重建、祖先序列推断、进化轨迹预测、进化参数估计以及选择和分子适应性检测等领域。在蛋白质层面，经验替代模型描述氨基酸替换的相对速率和平衡状态下的氨基酸频率，因易于集成到最大似然函数中而被广泛采用。然而，目前可用的蛋白质进化经验替代模型数量极为有限，仅约一百种，许多分类群仍未被充分覆盖甚至完全缺失。就病毒而言，尽管病毒种类繁多且具有独特的进化动力学，但专门针对病毒蛋白质开发的经验替代模型屈指可数，仅包括HIV-1、流感病毒、登革热病毒和黄病毒等少数模型。克里米亚-刚果出血热病毒（CCHFV）是一种分节段的负义单链RNA病毒，其基因组由小（S）、中（M）和大（L）三个片段组成，分别编码核蛋白（NP）、糖蛋白前体（GPC）和RNA依赖性RNA聚合酶（RdRP）。由于CCHFV具有中等进化速率、不断扩大的地理分布以及引发人类严重疾病的特点，且目前尚无特异性抗病毒疗法，因此亟需开发针对其蛋白质的特异性经验替代模型，以提高进化分析的准确性，进而服务于系统地理学研究和治疗策略设计。
研究方法概述
研究人员从NCBI数据库中检索了所有编码CCHFV三种蛋白质（NP、GPC和RdRP）的完整核苷酸序列，使用MAFFT进行多重序列比对，最终获得NP 657条、GPC 173条、RdRP 438条序列。随后，研究人员将每种蛋白质的数据集随机划分为两个独立子集：方法数据集（90%序列）用于模型推断，测试数据集（10%序列）用于性能评估。利用QMaker软件，通过最大似然法（ML）估计氨基酸对之间的相对替换率矩阵（20×20）和平衡状态下的氨基酸频率，推导出满足细致平衡条件的交换性矩阵，分别建立CCHFVnp、CCHFVgpc和CCHFVrdrp模型。模型被存入EModelDB公共数据库。此外，研究人员还分析了来自非洲、亚洲和欧洲不同地理区域的样本，以评估地理因素对替换模式的影响。模型性能评估方面，研究人员将CCHFV模型与ModelFinder中所有现有经验替代模型进行比较，同时考察了位点间速率异质性的影响，包括不变位点比例（+I）、伽马分布速率变异（+G）和自由速率分布变异（+R），并使用贝叶斯信息准则（BIC）和赤池信息准则（AIC）进行模型拟合度评价。
研究结果
3.1 经验替代模型揭示保守的氨基酸理化性质与蛋白质特异性进化模式
研究人员发现，CCHFV三种模型中最常见的氨基酸替换涉及赖氨酸-精氨酸、异亮氨酸-缬氨酸、天冬酰胺-丝氨酸、天冬氨酸-谷氨酸、丙氨酸-苏氨酸和苯丙氨酸-酪氨酸，这些替换通常保留了相似的理化性质如大小、疏水性和极性，表明存在维持蛋白质稳定性和功能的普遍选择约束。相比之下，CCHFVgpc模型表现出较高的丝氨酸-脯氨酸、脯氨酸-亮氨酸和甲硫氨酸-苏氨酸替换率，这些替换在GPC衍生的各蛋白质中均有分布，尤其在黏蛋白样结构域（MLD）中更为频繁。此外，半胱氨酸在CCHFVgpc模型中的平衡频率显著高于其他两种模型，这与病毒糖蛋白富含二硫键的结构特征一致。来自不同地理区域（非洲、亚洲和欧洲）样本的交换性矩阵与全球矩阵高度相关，表明地理因素对替换模式影响较小。
3.2 CCHFV经验替代模型在系统发育似然方面优于所有现有模型
对于每个测试数据集，CCHFV模型在AIC和BIC评分上均优于所有现有经验替代模型。在现有模型中，黄病毒（FLAVI）模型提供了次优的拟合效果。即使在引入位点间速率异质性（+I、+G、+R）后，CCHFV模型仍然保持最低的AIC和BIC得分，进一步证实了其优越性。
3.3 CCHFV经验替代模型与其他病毒特异性模型聚类
聚类分析显示，CCHFV三种模型与源自其他病毒的经验模型（如FLAVI和HIV模型）聚为一类，而非与线粒体、叶绿体或核蛋白的通用模型聚集。这表明CCHFV模型反映了病毒特有的进化动态，同时保留了CCHFV蛋白质进化的独特特征。
讨论与结论
尽管概率性系统发育方法需要分子进化替代模型，但目前可用的蛋白质经验模型数量极为有限，且此前没有任何针对CCHFV蛋白质的模型。本研究通过标准最大似然法推断出CCHFV三种蛋白质的经验替代模型。研究发现，CCHFV模型的氨基酸替换总体上保持了理化性质的保守性，但CCHFVgpc模型展现出独特的替换模式，尤其是涉及脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸的替换，以及更高的半胱氨酸频率，这些特征与糖蛋白暴露于免疫压力下的结构重塑和糖基化适应性有关。相比之下，内部蛋白NP和RdRP受更强的结构约束。地理区域间的替换模式高度一致，支持病毒进化主要由复制、传播和免疫逃逸驱动而非地理位置的论点。在似然比较中，CCHFV模型始终优于所有现有模型，且与病毒特异性模型聚类紧密。研究结论指出：蛋白质特异性经验模型能够比通用模型（如JTT和LG）更准确地描述病毒蛋白质进化；在缺乏特定模型时，其他病毒来源的经验模型是更好的替代选择；CCHFV模型的开发有助于提高系统地理学重建和病毒变体进化轨迹预测的准确性，为治疗设计提供依据；应加强对人畜共患病毒（如CCHFV）分子进化的研究，以支持有效治疗策略的开发。
