《Proteoglycan Research》：Hyaluronan in Ocular Surface Health and Disease: From Biological Mechanisms to Therapeutic Applications
透明质酸（HA）是一种普遍存在的非硫酸化糖胺聚糖，其独特的理化性质和生物学特性决定了它在组织稳态、修复和疾病中的重要作用。HA最早在眼的玻璃体中被发现，在眼科学中作为眼科黏弹手术装置和局部制剂的关键成分已有悠久历史。然而，除了其作为高度水合、黏弹性和润滑性聚合物所公认的生物物理功能外，HA现已被认为是细胞行为的动态调节因子，通过其大小依赖性地与特异性受体和细胞外基质成分相互作用而发挥作用。本综述全面概述了眼表HA生物学，涵盖其局部生物合成、周转、结构和理化性质，及其多样的生理和病理作用。我们简要讨论了HA的尺寸、组织方式、化学修饰及其受体调控其功能的分子机制。我们重点介绍了最新进展，表明HA在眼表组织中内源性合成并受到空间调控，包括角膜、角膜缘干细胞龛和睑板腺，在这些组织中HA调控组织生物力学、伤口愈合、干细胞维持、形态发生、衰老和炎症。最后，我们回顾了HA在眼表当前和新兴的治疗应用，包括滴眼液、水凝胶、纳米颗粒、生物材料和药物递送系统，并讨论了HA表征相关的分析挑战。综上所述，本综述将HA定位为眼表健康和疾病的基本内源性调节因子，以及一种多功能治疗平台，从而弥合了基础基质生物学与临床眼科学之间的鸿沟。
1 引言
透明质酸（HA）是一种普遍存在的细胞外基质（ECM）糖胺聚糖（GAG），是结缔组织的关键结构和功能成分。由于其卓越的保水性和黏弹性，HA有助于组织水合、润滑和生物力学稳定。除生物物理作用外，HA还通过与ECM蛋白和细胞表面受体的相互作用调节炎症、迁移和伤口愈合，从而调控细胞行为。基于这些重要作用，HA已被确立为维持包括眼表在内的多种组织结构与功能所必需的ECM关键成分。眼表是一个高度特化的解剖和功能单元，包括角膜、结膜、角膜缘、泪腺和睑板腺（MGs）以及泪膜，共同维持光学透明性、屏障完整性和免疫稳态。在持续承受机械、环境和生物应激的眼表环境中，HA具有至关重要的生物学意义。内源性HA通过维持角膜缘干细胞、促进上皮迁移和再上皮化介导的伤口修复、调控基质修复和炎症、通过稳定泪膜改善表面润滑和水合以及维持腺体功能，来维持眼表稳态。临床上，这些生物学特性已被应用于外源性局部HA制剂，广泛用于改善眼表病理生理状态。因此，理解眼表HA生物学对于将其天然生理作用与不断扩大治疗应用联系起来至关重要。
在本文中，我们涵盖了目前已知的HA生物合成、周转、结构、性质、作用机制、在发病机制中的角色及其在眼表治疗中的应用。通过将机制见解与临床和转化证据相结合，本综述旨在阐明为什么HA仍是眼表治疗中最多功能和生物学相关的分子之一，以及如何改进未来的HA策略以实现眼表疾病的精准治疗。我们进行了叙述性综述，以综合关于HA及其在眼表中的实验、转化和临床作用的文献。使用相关关键词和医学主题词（MeSH）在PubMed上检索文献，并通过手动筛选参考文献列表进行补充。优先考虑眼表背景下HA的研究，排除非英语文章、缺乏全文或方法学细节的研究以及与眼表生物学无关的研究。由于这是一篇叙述性综述，未遵循PRISMA指南且未纳入荟萃分析，允许整合性解释同时承认潜在的选择偏倚。
2 HA在眼科应用的历史概述
HA在眼科学中历史悠久，1934年Karl Meyer和John Palmer首次从牛玻璃体中分离出HA。通过结合希腊语“hyalos”（玻璃）和糖醛酸（构成HA链的二糖成分之一）将其命名为“hyaluronic acid”。1950-1960年代阐明了其在玻璃体和房水中的理化性质和天然丰度，确立了其作为维持眼部水合、透明性和减震关键分子的地位。1970年代HA-based眼科黏弹手术装置（OVDs）的引入是一个重要里程碑，通过保护角膜内皮细胞和维持前房深度革新了白内障和人工晶状体（IOL）手术。1970年代末至1980年代初，HA以Healon名称开始商业用于眼科和医疗用途。随后在1980-1990年代，HA因其润滑、保水和上皮愈合特性越来越多地被纳入人工泪液和干眼病局部制剂。1986年，随着对HA化学结构和物理状态的进一步理解，Endre Balazs提出将hyaluronic acid更名为hyaluronan，这更符合国际多糖命名法。1990年代初，IUPAC-IUB生物化学命名联合委员会推荐采用hyaluronan一词。因此，“hyaluronan”现为首选术语，尽管“hyaluronic acid”在某些语境下仍被广泛使用。此外，生物技术的进步使得能够生产高纯度、无内毒素的HA，提高了其在眼科应用中的安全性和性能。近年来，HA已扩展到药物递送系统、隐形眼镜涂层、伤口愈合和再生眼科学，包括角膜修复和玻璃体替代物。因此，从其在眼组织中的发现到现代治疗和手术角色，HA一直是眼科学中的基石生物分子。
3 HA在稳态和病理过程中的生物合成与周转
平均成人人体含有约15克HA。在组织中，HA主要以高分子量HA（HMWHA）或低分子量HA（LMWHA）存在，由每条链中d-葡萄糖醛酸（d-GlcA）和N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）二糖单元的数量决定。每个HA分子的二糖单元数从25到25,000不等，线性未卷曲HA聚合物的长度范围为10纳米至25微米。体内HA水平最高的组织是滑液和沃顿胶，含约2-4 mg/mL HA。其次是玻璃体，含约0.05-0.5 mg/mL HA。皮肤（特别是真皮）中的HA浓度约为0.05-0.1 mg/mL，体内约50%的HA位于皮肤。HA的摩尔质量从血清中的100 kDa到玻璃体中的8 MDa不等。与蛋白质在核糖体上以模板方式合成不同，HA在细胞膜上由单一酶——HA合酶（HAS）合成。由于HA是利用细胞质中的UDP-葡萄糖醛酸和UDP-N-乙酰氨基葡萄糖产生的，新生HA链通过HAS酶内的孔道挤出到细胞外环境中。
哺乳动物具有三种HAS亚型，即HAS1、HAS2和HAS3。每种HAS亚型具有特定的时空分布模式，但HAS2是表达最高且分布最广的亚型。事实上，Has2缺失小鼠是胚胎致死的，原因是心脏瓣膜和隔膜发育失败导致心力衰竭，这些小鼠还存在其他多种器官发育异常。另一方面，Has1和Has3双缺失小鼠是存活且健康的。Zimmer研究组最近表明，底物可用性和HAS酶内HA的协调影响所产生HA的分子量。HA无处不在，因此据信人体内所有细胞必须至少表达一种HAS亚型。
组织中HA的周转有一个严格调节的平衡，估计体内约30%的HA每24小时更新一次。组织中HA由透明质酸酶（HYALs）降解，人类有六种不同的亚型：HYAL1-4、HYAL-P1（一个转录假基因，在人类中不形成功能性蛋白）和精子特异性PH-20（SPAM1）。每种HYAL具有特定的催化特性，HYAL1、HYAL2和PH-20在细胞外区室表达，而HYAL3和HYAL4被推测主要在细胞内表达。HA的降解分两步：首先膜结合或分泌形式的HYALs将较大HA分子分解为较小片段，然后这些片段被引导至溶酶体切割成寡糖。细胞外空间中的活性氧（ROS）也能将HA切割成较小片段。HA链含有大量羟基和双键氧原子，对ROS高度敏感。事实上，HA被认为在组织中发挥重要的保护作用，吸收氧化损伤以替代DNA等其他细胞结构。通过HYALs的酶促消化产生不化学修饰HA链的产物；然而，ROS在切割位点化学修饰HA链，留下修饰的末端。化学修饰因特定ROS类型而异。研究人员先前已表明，过氧化氢（H
2O
2）和次氯酸（HOCl）切割产生的低分子量HA（LMWHA）和超低分子量HA（ULMWHA）修饰产物与大小匹配的天然HA相比，对角膜上皮细胞具有不同的生理功能。
4 HA的结构、性质和生物学功能
HA是一种线性、非硫酸化、带负电、水溶性、黏弹性、可生物降解的单体黏多糖，是地球上除几丁质和纤维素之外的三种主要β-链糖之一。它由重复的d-GlcA和GlcNAc二糖单元组成，通过交替的β-1,3和β-1,4糖苷键连接。与其他GAG不同，HA不发生硫酸化或表异构化，因此是所有GAG中结构最简单的。此外，HA是唯一不在高尔基体中合成且不以共价方式连接蛋白质形成蛋白聚糖的GAG。
HA具有独特的理化和生物学特性组合，使其区别于其他GAG并支撑其广泛的生理相关性。它最初被确定为一种空间填充分子，多年来仅被视为ECM的结构分子。事实上，HA在维持水稳态和组织结构支撑方面具有重要功能。HA是一种极度亲水的分子，因此在组织中具有高结合和保留水分的能力，在维持组织水合方面发挥重要作用，并有助于决定组织（如皮肤、软骨、滑液和玻璃体）的黏弹性。研究人员先前已表明HA调节角膜的生物力学特性。鉴于其物理性质，HA也被视为组织中的重要“空间填充物”和润滑剂。HA在组织中还具有保护作用，保护细胞免受机械应力和ROS的损害。HA的这些物理特性使其在临床上很有用，例如用于关节腔内注射补充滑液、在白内障或角膜手术期间注入前房、作为间质性膀胱炎的膀胱内治疗，以及作为皮肤和眼部损伤的局部治疗。
1989年，CD44被确定为HA的第一个特异性细胞表面受体，表明HA直接结合特异性细胞表面受体以引发细胞信号通路，从而通过直接结合细胞表面受体调节细胞功能。自这一重大发现以来，HA通过与细胞表面受体的结合被赋予了多种重要的生理功能，例如调节发育过程、免疫细胞和免疫反应、血管生成、肿瘤发生和干细胞维持。因此，除了其机械功能外，HA越来越被认为是具有生物活性的ECM调节因子，其作用高度依赖于分子大小、超分子组织以及与结合蛋白和受体的相互作用，如CD44、RHAMM、LYVE-1和HARE/Stabilin-2等。此外，HA具有高度生物相容性，易于化学修饰和交联，使其作为水凝胶、支架和药物递送平台中的多功能生物材料被广泛应用，用于再生和治疗目的。
5 HA的分析方法
HA生物学功能的多样性由其浓度和分子质量决定。因此，对其分析和表征需要简单、稳健且灵敏的分析方法。已有多种定量估算HA的分析方法，各有其特定优势和局限性，取决于样品复杂性和分析目标。表2列出了这些方法，其中列表A总结了测量HA含量/浓度的方法，列表B包含测量分子量的方法。
HA浓度传统上通过糖醛酸测定间接估算，包括咔唑法和阿尔辛蓝法，这些方法相对便宜且快速，但缺乏特异性和敏感性。基于CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）的浊度测定提供了一种基于HA-CTAB复合物形成的替代方法，但也可能受样品组成影响。更特异的方法包括基于HABP的免疫组织化学/免疫细胞化学方法和竞争性ELISA样测定，而AlphaScreen提供增强的敏感性。色谱方法如HPLC和LC-MS在HA水解和衍生化后提供定量分析，而MRI结合化学交换饱和转移（CEST）能够对GAG包括HA进行局部体内估算。总之，这些方法在特异性、灵敏度、成本和对复杂生物样品的适用性方面差异很大。
HA分子质量可以使用相对和绝对方法表征。相对方法包括黏度法、琼脂糖/PAGE电泳、荧光辅助碳水化合物电泳（FACE）、毛细管电泳和尺寸排阻色谱-HPLC（SEC-HPLC），后者能够同时评估HA浓度和分子质量。研究人员的实验室开发了一种SEC-HPLC方法，用于常规表征眼科产品中的HA。绝对分子质量测定可以通过光散射技术实现，包括多角度激光光散射（MALS）、动态光散射（DLS）和SEC-MALLS，而流动场流分离结合MALS和差示折射率检测对超高分子量HA特别有用。其他方法包括气相电泳迁移率分子分析（GEMMA）、基于纳米孔的分析以及光谱/生物物理技术，如NIR、ATR-FTIR、NIR-水组学和DOSY-NMR。
6 HA的细胞表面受体和其他相互作用分子
HA通过多种细胞表面受体和细胞外结合伴侣调节细胞行为。这些相互作用可大致分为经典HA受体（含有经典连接模块或HA结合基序，如CD44、LYVE-1）和非经典受体（通过替代基序识别HA，如RHAMM/HMMR）。此外，HA信号传导受模式识别受体、共受体和辅助ECM结合蛋白的影响，这些共同调节黏附、迁移、增殖、炎症和组织重塑。
6.1 分化簇44（CD44）
CD44是一种广泛表达的跨膜糖蛋白，以标准形式（CD44s）和多种可变剪接变体（CD44v）存在（外显子v1-v10），允许与各种ECM分子进行多样化相互作用，HA是其主要配体。通过与细胞骨架连接蛋白和受体酪氨酸激酶的关联，CD44转导细胞外信号以调节各种细胞过程，包括细胞黏附、增殖、存活、分化和迁移，从而调节免疫细胞运输、伤口修复和组织重塑等主要生理过程。CD44信号传导失调已被证明有助于癌症进展和炎症等病理状况。
在眼表，CD44在角膜、角膜缘和结膜上皮、角膜细胞和角膜缘血管中表达，但其在角膜中的作用仍有待确定。此外，泪液中可检测到可溶性CD44，进一步支持其参与眼表生理和炎症反应。然而，其在健康眼中的生理功能仍知之甚少。
CD44-HA相互作用促进白细胞黏附和跨内皮迁移，从而调节炎症细胞向组织的募集。CD44在发炎的眼表组织中表达增加，主要定位于上皮细胞和浸润免疫细胞。在干燥应激诱导的干眼病小鼠模型中，CD44在颈淋巴结和眼表的效应记忆Th17 CD4
+ T细胞上上调，标记驱动IL-17介导的慢性炎症和眼表损伤的组织归巢细胞。
在增殖性眼表疾病包括翼状胬肉和眼表鳞状细胞瘤中已有CD44表达改变的报道。CD44水平增加与细胞增殖增强相关，而在眼表鳞状细胞瘤中也与干细胞样表型相关，提示其在病理组织反应和疾病进展中的作用。尽管这些观察将CD44与疾病进展联系起来，但潜在机制仍不完全清楚。未来研究需要界定CD44在眼表稳态、伤口愈合和炎症反应中的作用。
6.2 HA介导运动性受体（RHAMM）
RHAMM或HA介导运动性受体（HMMR）是一种非经典HA受体，通过碱性B(X7)B基序（aa 635-646和657-666）而非经典蛋白聚糖串联重复HA结合基序结合HA。HA与RHAMM结合启动磷酸化级联反应，调节细胞信号传导、迁移、增殖，并参与急性和慢性炎症反应。
与CD44不同，RHAMM在大多数正常体细胞中表达低，包括内皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、未成熟胸腺细胞和B细胞，但在晚期癌症中经常上调，促进肿瘤进展。RHAMM缺乏破坏CD44介导的ERK1/2激活，损害成纤维细胞迁移、细胞骨架动力学，最终导致皮肤伤口修复缺陷。在同时表达CD44和RHAMM的RAS转化成纤维细胞中，仅RHAMM是HA刺激细胞运动所必需的，因为用特异性抗体阻断RHAMM可消除HA诱导的迁移，而抑制CD44则无效。
在CD44缺陷小鼠中，RHAMM补偿CD44的缺失以促进白细胞迁移和炎症信号传导。RHAMM在人结膜上皮中表达，并在严重的特应性眼表炎症期间上调，表明HA-RHAMM相互作用在调节炎症反应中的作用。研究小组先前已表明HA在损伤后上调，是调节炎症和伤口愈合反应的临时基质的关键成分。需要进一步研究来表征RHAMM在介导富含HA的临时基质在角膜伤口愈合中的作用。
6.3 淋巴管内皮HA受体-1（LYVE-1）
LYVE-1是连接模块家族的I型跨膜受体，与CD44相关，在传入血管和淋巴结窦的淋巴管内皮上高表达。它通过N末端连接结构域结合高分子量HA，促进HA摄取和转胞吞作用，并触发淋巴管生成反应，如内皮增殖、迁移和管形成。LYVE-1还参与树突状细胞和巨噬细胞的富含HA的糖萼，支持其通过淋巴管的黏附和转运，调节白细胞向引流淋巴结的运输。
在眼表，LYVE-1在结膜和角膜缘的淋巴管内皮和部分巨噬细胞样细胞中表达。研究小组先前已表明，在角膜中，HA通过LYVE-1调节淋巴管生成，HA形成发育过程中和损伤后淋巴管长入角膜所必需的支架。未来研究应致力于揭示HA调节角膜淋巴管生成的机制，并调查LYVE-1和CD44在调节淋巴管生成和血管生成中的潜在功能重叠。
6.4 Toll样受体2和4（TLR2和4）
TLR是在角膜和结膜上皮细胞上表达的关键模式识别受体，它们检测微生物成分和内源性危险信号以启动先天免疫反应。细胞表面TLR，特别是TLR2和TLR4，介导NF-κB激活和细胞因子产生，在感染或无菌损伤期间驱动白细胞募集和局部炎症。尽管LMWHA片段已被报道激活先天免疫细胞中TLR2和TLR4依赖的NF-κB信号，但HA直接参与这些受体仍存在争议。Dong等人（2016）表明，严格纯化、无内毒素的HA不激活巨噬细胞或树突状细胞，提示早前的促炎反应可能由污染物微生物产物而非HA本身引起。因此，需要进一步研究阐明HA通过TLR2和4的潜在信号传导，并确定HA:TLR轴是否在眼表稳态和/或病理中起作用。
6.5 HARE/Stabilin-2、Stabilin-1和Layilin（LAYN）
HARE（Stabilin-2）、Stabilin-1和Layilin是参与HA清除、免疫调节和细胞迁移的HA结合受体。HARE（Stabilin-2）介导HA和其他GAG的内吞清除，维持HA稳态并激活NF-κB和ERK1/2信号。Stabilin-1促进HA片段的摄取并有助于免疫耐受，而Layilin优先结合低分子量HA以调节细胞迁移和细胞骨架动力学。
在这些受体中，仅Stabilin-2在角膜和晶状体上皮细胞中有报道，提示其在局部HA周转和ECM稳态中的潜在作用，但其眼部功能尚未充分探索。相比之下，目前对Stabilin-1和Layilin在角膜、结膜或泪膜中的表达或功能作用直接证据有限，这凸显了眼表研究的一个重要空白。
7 HA结合ECM蛋白和透明质酸结合蛋白
HA是ECM中的关键分子，特异性结合并与多种蛋白质和蛋白聚糖相互作用，这些蛋白被称为透明质酸结合蛋白（hyaladherins），以产生结构和功能不同的超分子组装体，调节组织水合、机械弹性和细胞信号传导。形成的HA基质的具体组成直接调节HA的物理和生理特性。本文涵盖了眼表中存在的主要透明质酸结合蛋白。
7.1 Versican（VCAN）
Versican是一种多功能ECM蛋白聚糖，通过其N端G1结构域结合HA，而其额外结构域与其他ECM伴侣相互作用，从而形成富含HA的大分子复合物。可变剪接产生至少四种versican亚型（V0-V3），其中V0-V2携带硫酸软骨素链，V3缺乏。N端G1结构域结合HA，而C端G3结构域与ECM蛋白和硫酸化糖脂相互作用，介导Versican的结构和信号功能。
在大鼠角膜发育过程中，versican在早期出生后基质中高表达，与HA分布平行，表明其在基质成熟过程中组织富含HA的ECM中的潜在作用。Versican在视网膜中表达，其亚型调节ECM组成、细胞黏附和炎症，失调导致视网膜退行性疾病如Wagner病。研究小组先前已表明在成人角膜中观察到有限的versican表达，角膜缘中versican表达也有限。角膜损伤后versican表达上调，主要是V0、V1和V3亚型。在小梁网细胞中，抑制HA合成可降低versican和纤连蛋白水平，表明HA调节ECM组成和组织，这可能影响房水流出。
7.2 Aggrecan
Aggrecan是一种主要的ECM蛋白聚糖，具有多结构域核心蛋白（G1、G2、G3），修饰有硫酸软骨素和硫酸角质素链。通过其N端G1结构域，aggrecan与HA和连接蛋白结合形成聚集体，支持基质组织、水合和机械稳定性。
在正常人角膜中，aggrecan表达低，而在人工晶状体眼大疱性角膜病变（PBK）和Fuchs内皮性角膜营养不良（FECD）的基质中表达增加，表明其在内皮病理相关的ECM重塑中的作用。在未处理的野生型小鼠眼中，中央角膜或角膜缘区域未检测到aggrecan；然而，损伤后14天，它在上皮、周围基质细胞和内皮中表达，表明其在角膜伤口愈合中的作用。
在视网膜中，aggrecan表达随时间变化，在视网膜变性期间显著上调，表明其在应对光感受器丢失时ECM重塑中的动态作用。在衰老的人巩膜中，lumican与aggrecan形成高分子量复合物，提示其在与年龄相关的ECM重塑中的作用。在形觉剥夺性近视小鸡中，后巩膜aggrecan产生增加，促进ECM重塑和眼轴伸长。
7.3 TNFα诱导蛋白6（TNFAIP6）/TNF-α刺激基因6（TSG-6）
TNFAIP6（TSG-6）是一种分泌型糖蛋白，由N端连接模块和C端CUB结构域组成。其表达由促炎细胞因子在成纤维细胞、巨噬细胞和内皮细胞中诱导，主要介导抗炎作用，通过限制白细胞黏附、蛋白酶活性和NF-κB信号传导。TSG-6催化HC从inter-α-inhibitor转移至HA，形成HA-HC和HA?TSG6-HC复合物，这些复合物大多具有抗炎作用并有助于炎症消退。在某些病理过程中，HA-HC和HA?TSG6-HC复合物已被证明是促炎的。研究小组先前已表明内源性TSG-6在化学损伤后角膜中上调，调节炎症和伤口愈合。
7.4 Inter-α-胰蛋白酶抑制剂（IαI）
IαI是一种约225 kDa的血浆糖蛋白，由bikunin（一种Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂）通过硫酸软骨素部分与重链1和2（HC1和HC2）共价连接组成。TSG-6催化HC从IαI转移至HA，形成HA-HC复合物，可稳定ECM并形成调节细胞行为和调节炎症的特化基质。研究小组先前已表明间充质干细胞表达富含HA的糖萼，包含HCs、TSG-6和pentraxin 3（PTX3），赋予这些细胞免疫抑制特性。此外，人羊膜富含HA-HC/TSG-6复合物，当用作眼贴片时已被证明可抑制炎症并促进角膜伤口愈合。HC-HA/PTX3复合物也被证明支持角膜缘干细胞。研究小组最近表明ITIH5在角膜中组成性表达并在损伤后上调。ITIH5缺失导致角膜随年龄增长变薄和损伤后炎症反应增强。
8 HA在眼表的分布
尽管HA在过去40年中已广泛用于眼科学领域，但直到最近对眼表组织内HA的内源性产生和功能仍知之甚少。研究小组最近表明，在角膜中，HA主要在角膜缘区域产生，是角膜缘干细胞龛的主要成分。进一步研究表明HA调节角膜缘上皮干细胞（LESCs）的干细胞表型，角膜缘区域HA的缺失导致角膜缘干细胞缺乏症（LSCD），而离体扩增期间向LESCs补充HA可提高LESC存活率并支持干细胞表型。研究小组还表明HA在角膜缘区域内与重链2和5结合，形成HA/HC-TSG6复合物。此外，角膜损伤后HA上调，是临时基质的主要成分。研究小组还表明HA在角膜发育中具有重要作用，在早期发育阶段在整个小鼠角膜中高表达；然而到眼睛睁开时，中央角膜中的HA产生下调，而角膜缘区域仍保持高水平。HA还调节角膜淋巴管生成，在发育和病理状态下淋巴管长入富含HA的基质区域。此外，角膜中HA的下调导致淋巴管消退。最后，HA在调节角膜生物力学特性中发挥作用。此外，研究小组已表明HA在睑板中产生并围绕睑板腺（MG）。在MG中，HA调节MG形态发生和稳态，HA缺失导致MG萎缩。研究小组还表明，在小鼠中，随着年龄增长，睑板和MG周围的HA产生减少，HA的丢失导致年龄相关性MG功能障碍（ARMGD）。HA已被证明将MG细胞维持在增殖和未分化状态，HA缺失导致睑板腺细胞分化。此外，结膜和小梁网中HA产生高。总之，这些发现表明HA在眼组织中的广泛分布。在小梁网中，由HAS1和HAS2产生的HA有助于流出阻力，因此被认为是房水流出调节的关键调节因子。
9 内源性HA在眼表的生理作用
本文总结了HA在眼表生理作用中的最新进展，主要涉及眼表干细胞、衰老和炎症。
9.1 HA与眼表干细胞
干细胞在损伤或老化组织的修复和再生中发挥重要作用，从而维持稳态。它们存在于胚胎和成体组织中。干细胞的身份和功能受其周围特化和动态微环境——“干细胞龛（SCN）”控制，该微环境维持、调节和保护干细胞。SCN包含支持细胞、ECM、可溶性信号因子、机械信号、代谢条件和系统调节因子。ECM已成为SCN的重要指导性参与者，SCN内ECM的动态组成直接调节干细胞行为。
HA已被确定为SCN的主要基质成分，影响干细胞的迁移、增殖和分化。Toole和Gross观察到HA的积累与蝾螈再生肢芽中细胞迁移时期一致。HA的黏弹性和弹性有助于组织水合，削弱细胞对ECM的锚定，导致短暂细胞脱离从而促进细胞迁移和分裂。除直接与HA相互作用外，细胞通过与细胞表面HA受体（CD44、RHAMM、ICAM-1）相互作用介导各种细胞过程，如迁移，因为这些受体可能与多种与细胞运动相关的蛋白激酶形成连接。HA已被证明可保持长期培养的脂肪来源基质细胞（mADSCs）的增殖和分化潜力，并延长胎盘来源间充质干细胞（PDMSCs）的G1期转变以维持慢周期静息状态。同时，HA在某些干细胞类型中可发挥促增殖作用——例如通过Wnt/β-catenin信号刺激人羊膜间充质干细胞（hAMSCs）增殖，并通过TLR4和PGE2介导的EGFR激活促进Lgr5
+干细胞扩增。因此，取决于其分子量和受体相互作用，HA可以具有相反的效果，例如维持静息或增强增殖，维持干性或促进分化。
在角膜中，上皮干细胞位于角膜缘隐窝内，隐窝由纤维血管嵴形成，即角膜与结膜之间的环形过渡区Vogt栅栏，这些细胞被称为LESCs。LESCs的稳态维持和功能受角膜缘干细胞龛（LSCN）调节。研究小组已表明HA是LSCN的主要成分，LSCN中的HA调节LESCs特化。具体而言，研究小组已表明HA在体外和体内都是将LESCs维持在“干细胞”状态所必需的，HA缺失导致LSCD。最近，研究小组表征了LSCN内富HA基质的组成，并确定透明质酸结合蛋白inter-alpha-inhibitor（IαI）重链2和5、TSG-6和versican在角膜缘高表达。研究表明底物硬度直接影响LESCs。
9.2 HA与眼表衰老
HA在抗衰老中发挥重要作用，特别是在皮肤中。最长寿啮齿动物裸鼹鼠的抗癌性和卓越长寿也可能由超高分子量HA贡献。在眼表中，结构性和功能性异常随年龄增长而发展，最终导致视力丧失和生活质量下降。例如，角膜随衰老出现神经密度降低、内皮和基质细胞密度降低、上皮基底膜和Descemet膜增厚。此外，眼表相关腺体发生变化导致分泌改变、眼表不稳定和年龄相关性干眼病。研究小组先前已表明，随年龄增长MG基底层周围的HA表达减少，HA的缺失导致MG萎缩。此外，在腺体脱落（完全丧失）后，HA沉积在睑板内以替代经历萎缩的MG，形成纤维化沉积。因此，ECM的变化导致年龄相关功能衰退。
9.3 HA与眼部炎症和损伤
HA已被确立为炎症的关键介质，其作用以大小依赖方式发生。HMWHA通常具有抗炎作用，提供保护性ECM，维持组织水合、抑制免疫细胞激活并抑制NF-κB等促炎信号通路。相反，通常在组织损伤或氧化应激期间产生的LMWHA和HA片段作为内源性危险相关分子模式（DAMPs）。研究小组一直在积极研究内源性HA在眼表炎症中的作用，使用缺乏不同HA合酶（Has1
-/- Has3
-/-、Has2
ΔCorEpi）和透明质酸结合蛋白（Tsg6
-/-和Itih5
-/-）的小鼠模型。研究小组已表明HA缺失导致慢性炎症和伤口愈合失败。此外，Tsg6
-/-小鼠在损伤后24小时呈现降低的炎症反应，但损伤后14天出现更严重的瘢痕形成，表明经TSG-6修饰的HA基质在损伤后促进免疫反应，该反应是伤口愈合所必需的。此外，缺乏HC5的Itih5
-/-小鼠在损伤后呈现持续炎症和更严重的瘢痕形成。
10 外源性HA在眼表的治疗应用
自1934年首次从牛眼玻璃体中提取和表征以来，HA开始了其作为OVD成分的眼科之旅，用于1980年代的术中机械支持。随后在1990年代，HA的黏附性和润滑性特性将其临床应用扩展到局部滴眼液，早期研究已表明HA可以改善眼表舒适度并促进上皮伤口愈合。在过去二十年中，HA在眼科中的临床应用显著扩大。HA现被广泛用作干眼治疗的标准成分，同时发展成为一种多功能治疗平台，被纳入角膜绷带、隐形眼镜和眼部药物递送系统。总体而言，基于HA的疗法在不同损伤背景下均显示出良好的耐受性和一致的临床益处，促进角膜伤口愈合。
10.1 基于HA的滴眼液和人工泪液
眼表持续暴露于机械、环境和炎症损伤，其稳态弹性关键取决于泪膜的完整性和组成。HA因其润滑和泪膜稳定特性而被广泛用于人工泪液和滴眼液。HA的强黏附特性稳定泪膜，同时直接减轻眼表炎症并促进角膜伤口愈合，使其成为干眼病管理中的重要成分。尽管其临床使用广泛，但目前对于商业眼科制剂中使用的HA分子量或浓度没有标准化，导致产品间存在显著差异。市售滴眼液含有0.3 wt%至1.0 wt%的HA浓度，MW范围从约1100至250 kDa。尽管如此，多项研究表明增加HA分子量可改善润滑和患者舒适度，表明非常高分子量HA（vHMWHA）可能提供更优的症状缓解。
10.2 HA在OVDs中的应用
基于HA的OVDs代表了HA在眼科中最早期且临床上最成熟的应用之一，具有眼内安全和生物相容性的广泛记录。在白内障手术中，含HA的OVDs常用于维持前房稳定性并在手术操作过程中保护眼内组织免受机械和超声波损伤。数十年的成功临床使用为基于HA的眼科制剂建立了强大的安全框架，并促进了更先进HA治疗平台的发展。
10.3 用于眼表的HA水凝胶
尽管HA在滴眼液和人工泪液中广泛使用，局部给药制剂的疗效受到快速角膜前清除的限制。泪液周转、眨眼和鼻泪引流共同将滴注制剂在眼表的停留时间缩短至几分钟。为克服这些限制，已开发交联HA水凝胶作为能够增加眼表停留时间的眼部药物递送系统。除药物递送外，基于HA的支架也已被探索作为细胞递送和组织工程应用的基质。作为能够保留大量水的亲水性聚合物软三维网络，水凝胶可以维持与角膜上皮的长时间接触，同时抵抗眨眼引起的机械破坏。根据所采用的交联策略，HA水凝胶还可以作为伤口敷料和HA及其他治疗药物的控释系统。
已开发了多种制备HA水凝胶的方法，交联策略的选择、HA功能化的程度和类型以及HA的分子形式深刻影响所得生物材料的性质。重要的是，HA交联方式不仅改变水凝胶的机械性能，还改变其生物相互作用。化学交联通过HA链上羟基或羧基的反应性修饰引入共价键，形成机械稳定的凝胶，其硬度和降解动力学可根据特定应用定制。然而，HA主链的化学修饰，特别是在高取代度下，可降低CD44结合亲和力并改变HA与细胞外透明质酸结合蛋白的相互作用。除共价交联外，基于HA的系统还可以通过非共价结合稳定，包括离子相互作用、氢键和范德华力，这些有助于可逆网络形成和材料的黏弹行为。然而，这些物理交联系统通常稳定性较差，可能在膨胀或竞争性离子相互作用下解离。在眼部应用中，化学交联HA水凝胶因其增强的机械稳定性而更常用，而物理交联系统因其可注射性通常被优选用于后段递送。
HA水凝胶的多样化制备策略已转化为广泛的治疗应用。在最简单层面上，HA水凝胶用于延长HA在眼表的停留时间，该方法已在犬干眼模型中显示出功效。更重要的是，非交联HA溶液与交联羧甲羟丙基HA水凝胶（xCMHA-S）的直接比较表明，交联制剂比非交联HA溶液更快地促进犬和猫角膜上皮和基质溃疡的愈合。这些发现表明基质架构和结构稳定化本身是重要的治疗决定因素，独立于HA组成。
此外，HA水凝胶越来越多地用作组织工程中3D生物打印的生物墨水。为促进光交联和改善机械稳定性，HA通过甲基丙烯酸酯化进行化学修饰以生成HA甲基丙烯酸酯（HAMA）。该修饰在HA主链上引入甲基丙烯酸酯基团，在光引发剂如Irgacure 2959或LAP存在下经UV光照射可以发生自由基聚合。所得水凝胶的性质由几个关键参数控制，包括甲基丙烯酸酯化程度、HA浓度、光引发剂的类型和浓度、UV照射的强度和持续时间。总之，这些参数直接影响打印性、机械刚度、膨胀行为以及打印构建体中的细胞活力（如果使用细胞）。较高的甲基丙烯酸酯化程度和较长的UV照射通常产生更硬的水凝胶，可根据需要进行调整。
除浓度和交联化学外，用于眼部水凝胶和纳米颗粒平台的HA分子量也是可变的。在HA水凝胶隐形眼镜中，已使用vHMWHA（约1.2 MDa）。相反，眼部纳米颗粒制剂通常使用较低或中等MWHA，包括用于金纳米颗粒涂层的平均MW为19.69 kDa的硫醇化透明质酸盐、用于眼部基因递送的HA-壳聚糖纳米颗粒中约170 kDa的眼科级透明质酸钠，以及用于改善眼内移动性的HA包被金纳米颗粒中的LMWHA。这些例子表明HA眼部生物材料已在广泛的MW范围内开发，水凝胶隐形眼镜系统容纳MDa级HA，纳米颗粒系统通常使用较低或中等MWHA。
最近，基于HA的生物打印方法已被研究用于生成可用于体外研究和眼表治疗的功能组织。例如，开发了由没食子酸（GA）功能化HA、胶原I和HA包被的多壁碳纳米管组成的复合水凝胶，以支持细胞封装和改善生物制造。更先进的策略现在采用数字光处理（DLP）3D打印机来提高用于治疗LESCs缺乏症等应用的细胞支架制造的再现性和精度。
10.4 用于眼表的HA纳米颗粒
尽管交联水凝胶改善了眼部停留时间，但它们作为局部递送系统仍存在实际局限性，因为它们需要精确施用，可能暂时损害视力，并且并不总是适合常规患者自我给药。基于纳米颗粒的系统解决眼部药物递送挑战的不同方面。由于其亚微米尺寸，纳米颗粒可以穿透覆盖角膜上皮的黏液层，并在角膜前空间内比可溶性分子停留更久，从而改善药物生物利用度、组织渗透和保留时间。HA纳米颗粒有多种形式，包括自组装HA-药物复合物、HA包被纳米颗粒、HA-聚合物复合纳米颗粒、交联HA纳米凝胶、HA修饰脂质体和胶束。尽管HA纳米颗粒已被研究用于眼表疾病，但它们更广泛地被探索用于靶向后段疾病，包括年龄相关性黄斑变性、青光眼和糖尿病视网膜病变。
尽管其在持续药物递送方面具有显著潜力，但大多数基于HA的纳米颗粒系统仍处于实验和临床前发展阶段。例如，壳聚糖-HA纳米颗粒（CS/HA）已被证明可有效递送Epoetin Beta（EPOβ）至视网膜。在Wistar Hannover大鼠结膜下给药后，12小时内检测到EPOβ在视网膜中，并持续可检测长达21天，证明其延长视网膜递送能力。同样，CS/HA纳米颗粒也已显示出作为眼部基因治疗和青光眼治疗载体的前景。另一项研究调查了局部应用的HA包被金纳米颗粒作为后段药物递送载体，并证明与未包被金纳米颗粒相比，后段眼部分布增强，且不影响小鼠模型的视觉功能。最近，通过离子交联制备的地塞米松负载HA纳米颗粒（ADHA NPs）被证明在局部给药后可有效缓解干眼症状。这些纳米颗粒表现出强黏膜黏附特性、长达12小时的延长眼保留时间以及比游离地塞米松更强的抗炎活性，并具有高细胞相容性。此外，Schirmer泪液测试显示泪液产生增加两倍并维持稳定的泪膜。
10.5 HA在组织工程和再生眼科学中的应用
眼组织对基于生物材料的工程方法提出了特别苛刻的设计要求。工程构建体必须同时保持高含水量和光学透明性，同时支持上皮-基质整合并保持正常眼功能所必需的高度有序板层结构。由于角膜透明性和生物力学与组织微结构紧密相关，厚度、水合、透明性或基质组织的即使轻微变化也能显著影响视觉性能和眼组织力学。因此，组织工程策略旨在重建天然眼组织的层状组织、生物力学特征和光学特性。
HA化学与眼组织工程之间的关系导致了不断增长的生物材料类别的发展，这些材料不仅旨在替代受损组织，还积极促进组织再生。凭借其可调化学、高水合容量和优异的生物相容性，HA已被广泛研究作为靶向角膜和眼表的工程微环境的基质成分。基于HA的系统超越了传统体积水凝胶，包括组织粘附基质和细胞递送构建体，旨在促进无缝线移植并促进损伤后上皮和基质再生。此外，HA衍生物使得具有可调机械性能的结构有序构建体的制造成为可能，这对于厚度、分层和生物力学组织直接影响光学功能的眼组织尤其重要。
10.6 HA在隐形眼镜治疗中的应用
隐形眼镜已成为持续眼部递送HA和其他治疗药物的有吸引力的平台。其与泪膜的相容性、黏膜黏附特性、与眼表的几何一致性以及足够的机械完整性使其能够在角膜上延长保留并持续治疗释放。已采用分子印迹方法制造对HA具有增强亲和力的水凝胶隐形眼镜，从而与被动浸泡方法加载的镜片相比实现更慢和更受控的HA释放。该策略已通过直接掺入HA进入隐形眼镜并使用兔模型进行体内评估，泪液分析证明在延长的时间段内HA可用性持续。除持续药物递送外，HA也被纳入隐形眼镜系统以改善表面润湿性和佩戴者舒适度。使用点击化学方法将HA连接到隐形眼镜材料上或内部，研究人员实现了增强的表面水合和改善佩戴期间舒适度。最近，隐形眼镜技术已发展为多功能治疗平台，将HA与其他生物活性和表面工程策略相结合，突显HA作为先进隐形眼镜治疗中模块化组件的扩展作用。
11 结论和未来方向
HA已成为眼表发育、稳态和生理学的重要参与者，不仅是作为被动润滑剂，而是作为组织水合、屏障完整性、免疫反应和干细胞龛的动态调节剂。眼表中的内源性HA，例如在角膜缘和MG中，对上皮更新、伤口愈合和抵御年龄相关腺体病理至关重要。HA合成、分子量分布或周转的改变与衰老、慢性炎症和退行性眼表疾病相关，提示内源性HA作为评估组织健康、疾病进展和再生能力的生物标志物具有重要前景。外源性给药HA，特别是局部制剂，长期用于其润滑和保护特性。然而，新兴证据表明外源性HA可以主动调节上皮修复、免疫反应和干细胞行为，取决于其浓度、分子量和化学修饰。这为将HA治疗用途扩展到症状缓解之外开辟了可能性，包括靶向伤口愈合、炎症控制和基于干细胞的再生支持。
尽管有这些有希望的途径，但目前仍存在几个局限性。HA的生物学效应高度依赖于背景，并受浓度、分子量和受体相互作用的影响。在眼表的严重病理状态下，外源性HA可能因组织穿透或受体表达改变而疗效有限或产生不可预测的效应。此外，长期或高浓度HA应用可能破坏天然HA代谢或改变内源性基质平衡。此外，测量眼组织中HA含量、治疗方案和尺寸分布及生物活性的标准化方法仍缺乏，使临床转化和机制研究解释复杂化。因此，在分子、细胞和组织水平上详细理解HA生物学对于充分发挥其作为眼病理生理学生物标志物和治疗靶点的潜力至关重要。眼表HA生物学领域的未来研究可致力于改进诊断工具、优化治疗配方和开发利用HA多方面作用的再生策略。先进技术在泪液或眼组织中测量HA，特别是具有分子量分辨能力的技术，可以实现非侵入性或微创监测眼表状况。总之，HA代表了眼表内源性基质生物学与外源性治疗干预之间的独特交汇。通过利用其作为生物标志物和治疗剂的双重角色，未来策略可以更有效地利用其在维持眼表健康和疾病治疗中的全部潜力。
