基于电子活化解离的中下水平质谱分析二硫键与游离巯基技术及其在单克隆抗体生物治疗片段表征中的应用

《Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis》：Electron Activated Dissociation Technique for Middle-Down Mass Spectrometry Analysis of Disulphide Bonds and Free Thiols: Application in Characterising Monoclonal Antibody Biotherapeutic Fragments

优化后的电子活化解离（electron activated dissociation, EAD）可在完整蛋白质上产生指示二硫键（disulphide bond, DSB）位置的诊断性碎片离子模式。该诊断模式被应用于通过EAD绘制抗体亚基上的链内二硫键图谱、区域特异性游离巯基定位以及潜在的二硫键错配（disulphide scrambling）分析。利用EAD对50 kDa和100 kDa亚基上的链间与链内二硫键进行了评估。通过EAD确认了热诱导产生的生物治疗片段。

**论文解读**

**一、研究背景与意义**

单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）及其相关产品的疗效与安全性与其整体结构完整性密切相关。二硫键（disulphide bond, DSB）是连接半胱氨酸残基巯基的关键共价键，通过大量链内和链间键显著影响抗体的构象结构。然而，在生产、制剂和储存过程中，DSB可能发生不完全形成或诱导还原（例如来自宿主细胞蛋白如硫氧还蛋白、硫氧还蛋白还原酶或金属离子如Zn²⁺、Ag⁺），导致未配对半胱氨酸产生游离巯基。错误的DSB和游离巯基可指示不完全或错误折叠、氧化应激、降解等问题，从而损害产品质量和治疗适用性，甚至引发安全性担忧。DSB缺陷会扭曲mAb结构，影响与抗原的药效学相互作用和药代动力学，可能导致意外的药物清除和不良反应。此外，DSB还原和游离巯基可促进分子间二硫键交换，分别导致二硫键连接降解片段或聚集体的形成，具有潜在免疫原性后果。因此，DSB和游离巯基被列为关键质量属性（critical quality attribute, CQA），需密切监测和表征。

传统光谱方法（如Ellman试剂测定）虽快速简便，但只能提供总游离巯基测量，缺乏位点或结构域特异性及分布信息，且需较大样品量，易在样品制备中产生DSB错配伪影。质谱（mass spectrometry, MS）凭借高灵敏度、准确度和精密度成为蛋白质和mAb表征的有力工具。现有的DSB和游离巯基分析方法涵盖bottom-up、middle-down和top-down水平。但bottom-up方法因涉及变性、长时间胰蛋白酶消化等多步骤，易发生二硫键还原。而middle-down和top-down方法大多依赖提取离子色谱图（extracted ion chromatogram, XIC）和完整质量去卷积，只能提供整个mAb分子或亚基内的总游离巯基信息，结构域特异性有限。基于碎裂（MS2）的定位仍受限，如HCD对大分子蛋白碎裂效率低。因此，需要更高效的碎裂方法来实现DSB和游离巯基的精准定位。

本研究正是基于这一需求，开发了一种基于Sciex ZenoTOF 7600+平台电子活化解离（electron activated dissociation, EAD）的middle-down方法，用于表征mAb中的链内和链间DSB、游离巯基、DSB错配及含DSB降解片段。该方法样品制备简单，可最大限度减少样品制备诱导的DSB错配，为生物治疗药物稳定性评估提供快速、结构特异的互补信息。

**二、研究内容与结论**

研究人员首先以具有明确DSB结构的牛核糖核酸酶A（bovine ribonuclease A, RNase A）和鸡溶菌酶为概念验证蛋白，评估EAD碎裂行为。完整质量分析确认了还原前后巯基状态。EAD-MS/MS结果显示，非还原蛋白中受DSB约束的区域骨架碎裂显著减少，序列覆盖度仅53%（RNase A）和46.9%（溶菌酶）；而还原后碎裂增强，序列覆盖度提升至92%和94.5%。这归因于DSB约束区域的非解离电子捕获、电子可及性受限以及DSB裂解与骨架裂解的竞争。此外，DSB靠近末端时（如溶菌酶Cys6–Cys127），末端快速裂解可提供残余能量促进超越DSB位点的骨架碎裂，但效率仍低于还原形式。

随后，研究人员将方法应用于NISTmAb RM 8671亚基。对IdeS消化产生的Fc/2亚基（约25 kDa）分析中，观察到质量偏移约+2 Da的Fc/2*变体，EAD碎裂在CH3区域出现增强的z离子，而CH2区域碎片模式与Fc/2类似，表明游离巯基位于CH3结构域，且并非CH2/CH3混合还原。进一步通过温和DTT还原F(ab)2获得Lc和Fd'亚基，EAD分析显示Fd'*在CH1区域碎片增加而Cys223–Cys232区域碎片减少，提示发生DSB重排即错配；Lc*则出现+1 Da质量偏移，在Cys193–Cys213区域碎裂减少，提示可能发生部分或瞬时链内DSB还原及新二硫键形成，但无法完全排除低丰度物种和去卷积伪影的影响。

对于具有链间DSB的较大亚基，研究人员用IgdE和IdeS酶分别生成约50 kDa的Fab和Fc及约100 kDa的F(ab)2和Fab/c。EAD-MS/MS分析Fab时，Fd'和Lc均保留DSB保护区域的低碎裂特征，Fd' N端碎裂更强，整体序列覆盖度较低（Fd' 35.1%，Lc 37.2%），链间DSB靠近C末端时可被EAD诱导“还原”，但效率低于N端。通过诱饵搜索（用非NISTmAb序列匹配）验证了片段分配的特异性。Fc亚基为N端由两条链间DSB连接的同源二聚体，EAD可诱导链间二硫键与骨架的同时裂解，但N端二硫键约束显著影响下游CH2和CH3区域的c离子形成，而C端方向碎裂相对不受限，产生较多z离子。USP001 mAb的Fab和Fc结果与NISTmAb高度一致，证明方法在不同抗体间的可重复性。

最终，研究人员对热应激（50°C，28天）的NISTmAb样品进行降解片段鉴定。在降解样品中鉴定出两个片段：片段I质量13555.67 Da，经EAD-MS/MS序列覆盖度比较，确定为重链329–449片段（48.3%覆盖度）而非轻链1–126片段（5.5%覆盖度）；片段II为游离轻链，在对照和应激样品中均存在，但应激样品中信号增强，表明热应激可部分诱导其产生。

**三、关键技术方法**

研究采用的关键技术包括：（1）微流液相色谱-质谱联用（ACQUITY UPLC M-Class耦合ZenoTOF 7600+ MS），配备nanoEase M/Z Protein BEH C4色谱柱；（2）多反应监测高分辨（MRM^HR）模式的EAD串联质谱（MS/MS），优化电子束电流、电子动能、反应时间等参数；（3）Biologics Explorer软件进行质量去卷积、序列覆盖度计算和EAD top-down测序注释；（4）诱饵搜索策略验证片段分配特异性。样品队列包括NISTmAb RM 8671、USP001 mAb、USP002 mAb、牛核糖核酸酶A和鸡溶菌酶；使用IdeS、IgdE和EndoS酶进行消化；热应激样品按工业指南制备。

**四、结果讨论与结论**

讨论部分指出，EAD碎片模式强烈依赖于DSB位置、多个DSB的聚集以及蛋白质整体大小。链内DSB抑制局部骨干碎裂，形成可识别离子图谱；链间DSB位于末端时，EAD可诱导“二硫键还原”现象。该方法能实现结构域水平游离巯基定位和DSB错配检测，但对低丰度物种和共洗脱峰仍存在解释不确定性。

研究结论：本工作证明了Q-TOF系统结合EAD可快速表征DSB、游离巯基、错配DSB和含DSB降解产物。该工作流程样品制备需求极少，相比传统bottom-up方法降低了制备诱导DSB错配风险。EAD产生DSB相关独特碎片模式，可识别蛋白内受DSB保护和暴露区域。方法首先在RNase A和鸡溶菌酶中验证，随后应用于NISTmAb和USP001 mAb亚基，绘制链内DSB图谱，鉴定并定位结构域水平游离巯基，表征DTT诱导的DSB错配，并扩展至含链间二硫键的Fab、Fc、F(ab)2和Fab/c更大亚基。最后成功用于热应激NISTmAb降解产物鉴定，证明该技术在生物治疗产品稳定性快速评估中具有实用价值，尤其可为强制降解研究提供超越完整质量测量的互补结构信息。然而，当前工作流仍需要较多手动操作（电荷包络评估、前体选择、MS/MS数据评价，每个样品约30–60分钟），未来自动化改进有望提高通量和可重复性。