FFPE肿瘤中基因组测序较外显子组测序展现诊断优势并改善分子肿瘤委员会治疗决策

《Cancer Medicine》：Genome Sequencing Outperforms Exome Sequencing in Formalin-Fixed Paraffin Embedded Tumors Leading to Improved Treatment Options

精准肿瘤学基于对患者肿瘤的全面分子表征。这主要通过下一代测序（NGS）panel或外显子组测序（ES）实现。关于临床环境中对甲醛固定石蜡包埋（FFPE）材料进行基因组测序（GS）价值的数据仍然稀缺。在这项试点研究中，研究人员生成了来自15例癌症患者的FFPE肿瘤样本的匹配外显子组测序和基因组测序数据集，以基准评估质量指标、临床可行性及对分子肿瘤委员会（MTB）的附加价值。尽管测序深度降低，与ES相比，GS在诊断检测小核苷酸变异、拷贝数变异（CNV）和复杂生物标志物方面仍得以维持，难测序区域除外。本地MTB评估发现，20%（3/15）的患者获得了高优先级的额外治疗推荐，另有20%（3/15）的患者获得了支持现有治疗推荐的额外分子标志物。研究人员的工作强调了GS即使对FFPE样本也具有诊断优越性，因此支持将其整合到临床实践中。

在精准肿瘤学时代，基于下一代测序（NGS）检测肿瘤特异性致癌改变已成为选择靶向治疗患者的重要手段。肿瘤测序结果通常在跨学科分子肿瘤委员会（MTB）中讨论，并据此推荐个体化治疗策略或合适临床试验。目前主要通过专门panel或外显子组测序（ES）实现，后者覆盖全部编码序列，约占人类全基因组1%。理想情况下，肿瘤分析应尽可能广泛；基因组测序（GS）可提供当前最全面的遗传改变分析。已有报道GS在罕见病和实体瘤中较ES或其他NGS panel具有附加诊断价值；技术上，GS因覆盖均一性增强、拷贝数变异（CNV）和结构变异（SV）检测能力提高而优于ES。然而，这些通常需要来自外周血或新鲜冷冻（FF）肿瘤组织的高质量DNA。常规临床实践中，肿瘤样本绝大多数为甲醛固定石蜡包埋（FFPE）材料，因其广泛用于病理长期保存和组织学评估。固定过程可导致DNA片段化、产量降低和二次修饰，使FFPE材料肿瘤GS在技术上具有挑战性。尽管如此，越来越多证据支持FFPE肿瘤GS的临床实用性和可行性；但既往研究多将FFPE肿瘤GS与panel分析或FF样本GS结果比较，配对FFPE与FF样本数量有限，且FFPE肿瘤GS在MTB背景下的诊断价值数据稀缺。因此，研究人员旨在通过FFPE肿瘤GS与ES测序结果的直接头对头比较，进一步研究FFPE肿瘤GS的技术和临床适用性；生成15例癌症患者100 ng FFPE肿瘤DNA及对应外周血正常DNA的匹配ES和GS数据，强调潜在陷阱并提出成功开展肿瘤FFPE GS的最低要求；在这一涉及可用肿瘤组织类型和数量的真实世界场景中，证明GS维持较ES更优的诊断性能，并在40%（6/15）患者中具有附加诊断价值。

技术方法概括（不超过250字）：研究纳入15例患者，其中14例为晚期癌症患者，来源于德国个性化医学网络内Tübingen个性化医学中心前瞻性观察研究MTB@ZPM（NCT03503149），1例为神经鞘瘤病（schwannomatosis；ORPHA:93921）患者；FFPE组织以10%中性缓冲福尔马林固定6–24 h后石蜡包埋，要求FFPE提取肿瘤DNA>200 ng以分别提供100 ng用于ES和GS。研究人员对匹配肿瘤—正常DNA进行GS和ES文库构建及Illumina平台双端测序，使用megSAP流程、Illumina DRAGEN进行比对和变异检测，ClinCNV检测CNV，Manta检测SV，GSvar解释和报告，按VICC分类体细胞变异；TMB按Johnson et al.计算，HRD-Score为体细胞LOH、TAI和LST之和且>42为HRD阳性，MSI用MSIsensor-pro且>10%为MSI阳性，SigProfilerExtractor提取突变特征；以GIAB HG001/HG002验证SNV，CNV以ES结果为参考评估。

研究结果如下。

3.1 测序数据质量：研究人员对15例不同肿瘤类型患者的FFPE肿瘤DNA进行ES和GS，肿瘤含量10%–90%。通过测序质量指标比较发现，ES与GS比对率相似；GS数据质量略差，插入片段长度和Q30碱基比例降低；GS肿瘤和正常样本中位覆盖度分别为110和36，ES分别为353和195；GS覆盖异质性改变，表现为AT dropout降低而GC dropout增加，肿瘤GS样本中高GC区域代表性不足最明显。以1160个癌症相关基因（4.6 Mb）为体细胞目标区域，肿瘤GS样本平均49%区域达到100×，正常GS样本95%区域达到至少20×；在超过50%样本中存在的<20 reads低覆盖区域分别占肿瘤和正常样本体细胞目标区域1.5%和1.6%；TERT启动子c.-124和c.-146位点在80%（12/15）和67%（10/15）肿瘤样本中覆盖<20 reads。生物信息学验证显示，在10%等位基因频率下，GS和ES的SNV检测灵敏度均>95%、精确度>99%；INDEL检测灵敏度同样降低。结论是GS在FFPE样本中总体可获得可靠SNV检测所需质量，但覆盖均一性受GC富集区域影响。

3.2 GS分析的诊断效用：由于测序质量、目标区域和覆盖度差异，研究人员在既定MTB结构下比较GS能否替代ES用于诊断。通过比较各患者GS和/或ES检出小变异的变异等位基因频率（VAF），发现一致性小变异VAF相关性良好，但有相当数量小变异仅由一种系统检出；这些独有变异多数VAF<10%，且不属于诊断相关变异类别或基因。仅看癌症相关基因时，仅ES检出的错义变异和INDEL比例较高，多为VAF<10%的亚克隆变异；设置诊断报告所需VAF>10%阈值后多数被去除；但GS即使对高VAF错义和INDEL也不能完全捕获，原因是相应基因组位置覆盖<20 reads。以ES检出SNV为参考评估GS召回，所有癌症相关基因SNV在GS中100%召回仅见于3/15患者；仅评估可能致癌/致癌SNV时一致性改善，但13例有致癌SNV患者中6例初GS分析因低覆盖漏检；引入GS特异过滤（纳入肿瘤或正常样本覆盖<20的变异）后，11/13患者所有致癌SNV被正确识别；仍缺失2个致癌变异位于TERT启动子，因覆盖仅3和6 reads。CNV评估显示，GS识别44%（67/154）扩增（AMP）、98%（98/108）杂合缺失（het DEL）、94%（14/15）纯合缺失（hom DEL）和100%（3/3）拷贝中性杂合性缺失（LOH）；扩增允许拷贝数偏差1或2时另增加29%（45/154）；16%扩增未检出，主要为克隆性<20%的亚克隆；扩增差异≥3多因ES和GS克隆性分配不同；1个ES纯合缺失在GS的CNV流程中判为杂合缺失，但经SV检测正确识别为纯合缺失。复杂生物标志物方面，TMB、HRD和MSI在GS与ES间呈良好正相关（Spearman相关系数分别为0.98、0.85、0.89）；TMB在GS中略但显著升高，可能因目标区域扩大；HRD-Score在GS中显著降低，可能与ES亚克隆CNV calls较多有关；患者8为三阴性乳腺癌（TNBC）且从PARP抑制剂治疗获益，ES HRD-Score 51、GS 55，均判为HRD阳性；MSI无显著差异，但队列无MSI阳性患者；突变特征在ES中2例、GS中4例显示癌种特异性特征，UV暴露相关SBS7a、SBS7b在3例皮肤黑色素瘤GS中均检出而ES仅2例，HRD相关SBS3仅在GS的HRD阳性TNBC患者中检出；队列太小不足以进行特征与肿瘤属性相关分析。结论是GS在FFPE肿瘤中总体维持诊断相关SNV、CNV和复杂标志物检测能力，但需针对低覆盖区域调整过滤并谨慎解释TERT启动子等难测序区域。

3.3 GS分析的附加诊断价值：通过MTB评估两种分析，GS在6/15患者中发现额外致癌改变，归因于对SV和局灶缺失CNV检测增强；新发现包括PTEN纯合缺失（n=2）、CDKN2A纯合缺失（n=1）、MAP2K4纯合缺失（n=1）、BRAF纯合缺失（n=1）和ARID1B纯合缺失（n=1）。这些改变影响不同信号通路，经本地MTB评估转化为新的治疗选择。患者2为胰腺腺癌（PAAD），检出MAP2K4纯合缺失/易位和ARID1B纯合缺失，涉及MEK-ERK通路激活，MAP2K4对应MEK抑制（如trametinib、selumetinib、binimetinib；NCT/ZPM证据m3；ESCAT Tier V），ARID1B无推荐，原第一优先级推荐获进一步支持。患者7为原发灶不明黑色素瘤（MUP），检出MAP3K8-PARD3倒位和BRCA1两处倒位，涉及MEK-ERK通路激活和潜在HRD，MAP3K8-PARD3对应MEK抑制（NCT/ZPM证据m3；ESCAT Tier V），BRCA1对应Olaparib+Pembrolizumab（NCT/ZPM证据m2C），形成新的第三优先级。患者8为TNBC，检出JAK1-SETD2易位、SETD2易位和NBN易位，涉及HRD，NBN对应Olaparib+Ceralasertib（NCT/ZPM证据m1C），SETD2对应Camonsertib（临床试验NCT 04589845），原推荐因识别HRD体细胞驱动而获支持。患者9为皮肤黑色素瘤（SKCM），检出PTEN纯合缺失、BRAF外显子3–10纯合缺失和ATR 5处倒位，涉及MTOR通路激活、替代BRAF产物和潜在HRD；BRAF改变提示对BRAF抑制耐药，PTEN对应Capivasertib+Paclitaxel（NCT/ZPM证据m2C）及对T细胞介导免疫治疗耐药，ATR无推荐；原第一优先级因检测到耐药而丢失，并形成新的第一优先级。患者12为腹膜间皮瘤（PEMESO），检出CDKN2A纯合缺失，涉及细胞周期激活，对应Abemaciclib（NCT/ZPM证据m1C），为原第三优先级提供额外支持。患者13为SKCM，检出PTEN纯合缺失，涉及MTOR通路激活，对应Capivasertib+Paclitaxel（NCT/ZPM证据m2C）及对T细胞介导免疫治疗耐药，形成新的第一优先级。另有3例患者因HRD相关基因BRCA1、SETD2、NBN和ATR的易位或多发倒位提示HRD，其中患者8同时HRD-Score阳性，支持既往PARP抑制剂推荐。患者7的MAP3K8激活融合补足了ES未发现的致癌驱动，带来MEK抑制剂第三优先级（m3；ESCAT Tier V）。患者9的BRAF内部缺失提示BRAF抑制剂耐药，原第一优先级被撤销。总体而言，GS检出的额外改变使3例患者获得新的高优先级推荐，3例患者现有推荐获进一步支持，1例患者检测到靶向治疗耐药。结论是GS因增强SV和CNV检测，在FFPE样本中可提供额外临床可操作信息并影响MTB治疗决策。

讨论部分总结：FFPE材料长期被认为不适合GS，限制其在肿瘤诊断中的广泛应用；本研究以100 ng DNA开展FFPE肿瘤GS，并与匹配ES直接比较，得以识别FFPE GS潜在陷阱并提出应用和数据解释的最低要求；GS在SV检测上的优越性使40%（6/15）癌症患者发现额外改变，MTB评估显示其临床重要性和对患者管理的影响。测序质量总体足以实现与ES相当的可靠SNV检测；由于两种肿瘤分析使用同一FFPE DNA，未评估FFPE伪影含量；质控显示覆盖不均一，GS较ES增强，可能与GS方案中PCR非特异扩增输入DNA、而ES方案富集低代表区域有关。覆盖均一性丢失主要影响GC富集区域并导致覆盖缺口，包括诊断相关TERT启动子；调整变异过滤以纳入低覆盖区域可部分解决，但不能挽救极低覆盖区域，因此TERT启动子致癌变异阴性结果应结合相应基因组位置测序深度谨慎解释和报告，并需技术改进难测序区域。SNV检测差异多数VAF<10%，与VAF低于10%时灵敏度下降一致，尤其GS；建议诊断报告VAF cutoff为10%；结合GS平均深度降低，需足够肿瘤含量；患者11肿瘤含量10%时GS丢失50%（4/8）体细胞SNV，其余样本SNV召回充分，提示肿瘤GS至少需30%肿瘤含量，与大型研究建议20%–30%肿瘤含量联合100×覆盖一致。HRD-Score在GS显著降低，因ES和GS的CNV检测技术不同，ES中CNV calls更碎裂且多数断点未被ES覆盖；HRD-Score原基于SNP array，既往已显示可用于ES和GS，本队列HRD阳性患者在ES和GS均>42；de Luca et al.提示不同检测可能对部分患者HRD分类不同，建议纳入突变特征或HR基因突变状态；GS可检测更多特异性突变特征，但需更大肿瘤队列确定GS的HRD-Score和TMB cutoffs。技术要求包括优化DNA片段化以获得250 bp插入片段（Xiao et al.推荐）；本研究需200 ng FFPE DNA以对同一标本进行匹配ES和GS，可能偏向DNA质量较好的标本，但GS方案用于诊断认证时50 ng输入获得类似结果（数据未展示）；100 ng起始DNA需文库前PCR扩增，PCR可增强AT/GC偏倚，应尽量减少，本研究肿瘤和正常DNA分别用5和3个循环；GC dropout高提示应优化PCR退火温度以改善覆盖均一性；检测VAF低至10%的变异，肿瘤DNA最低测序深度100×、正常DNA 30×，每对肿瘤—正常样本使用2500×10⁶测序簇；诊断用途中增加簇数后肿瘤样本85%目标区域达到100×，但因未做配对分析未纳入本报告。GS覆盖全部内含子区域，较ES大幅增强SV和CNV断点检测，这在本研究中体现为GS检测局灶纯合缺失和SV从而发现额外致癌改变；MTB临床评估显示其高可操作性：20%（3/15）患者现有治疗选择获支持，7%（1/15）检测到靶向治疗耐药，20%（3/15）患者获得新治疗选择；这与78例黑色素瘤研究中GS较panel分析获得38%额外可操作标志物和18%新治疗选择的结果相当；对ES未识别致癌驱动的患者进行预选可显著提高GS识别驱动或可能驱动改变的比例至68.4%和22.6%，本研究中患者7即体现GS补足缺失驱动。更大规模>700例FF材料肿瘤GS研究显示，与in silico ES或panel分析相比，GS增加临床试验生物标志物检测，但获批药物生物标志物检测率仅边际增加；作者承认GS数据in silico降采样不能完全反映真实世界ES的偏倚和技术缺陷。研究结论翻译：总之，研究人员对不同癌症类型患者队列中GS与ES的头对头比较表明，FFPE材料的肿瘤GS是检测肿瘤变异的可靠工具。与ES相比，GS识别出更多临床可操作改变。这支持将其常规整合到MTB临床诊断中，因为它有可能显著增强癌症患者的个体化治疗决策。GS在个体化医疗中的适用性目前正在大型国家计划如德国“Model Project Genome Sequencing”中评估。当前研究为肿瘤GS的实施及其在个体化癌症诊疗中的整合提供了指导。