《Journal of Drug Delivery Science and Technology》：Engineered
Salmonella-Based Therapeutic Delivery System for Localized TRAIL and IL-2 Expression in Colorectal Cancer
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靶向细菌基因递送系统通过选择性瘤内表达治疗性分子并降低全身毒性，已成为局部癌症治疗的有前景策略。本研究将减毒鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）SL3261菌株工程化，使其在缺氧响应性nirB启动子控制下表达肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配
靶向细菌基因递送系统通过选择性瘤内表达治疗性分子并降低全身毒性，已成为局部癌症治疗的有前景策略。本研究将减毒鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）SL3261菌株工程化，使其在缺氧响应性nirB启动子控制下表达肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）和白细胞介素-2（IL-2），并在结直肠癌模型中评估其抗肿瘤效果。通过荧光分析和酶联免疫吸附测定（ELISA）在氧受限条件下确认了重组蛋白的表达。通过活力测定、一氧化氮定量和凋亡分析，在HCT-8结直肠癌细胞中评估了抗肿瘤活性。在携带HCT-8异种移植瘤的BALB/c裸鼠中，通过瘤内给予重组菌株评估体内治疗效果。含重组蛋白的上清液显著降低肿瘤细胞活力，并增加凋亡和坏死细胞群体。含IL-2的处理与一氧化氮产生增加相关。在体内，重组沙门氏菌菌株显著抑制肿瘤进展并降低肿瘤重量，其中TRAIL与IL-2联合治疗表现出增强的抗肿瘤疗效。组织学分析显示广泛的肿瘤坏死，而生物分布测定证明细菌优先在瘤内积聚。这些发现支持基于工程化沙门氏菌的系统作为联合癌症免疫治疗的有前景的局部递送平台。
一、研究背景与问题
结直肠癌是全球癌症相关死亡的主要原因之一，也是最常见的胃肠道恶性肿瘤。近年流行病学研究显示早发性结直肠癌发病率呈上升趋势。结直肠癌的发生发展涉及细胞增殖失调、凋亡抵抗、慢性炎症、组织侵袭和转移播散等多因素过程。尽管手术、化疗、靶向治疗和免疫治疗取得了显著进展，晚期结直肠癌的治疗仍面临肿瘤异质性、治疗耐药、肿瘤选择性有限以及常规治疗相关全身毒性等挑战。因此，开发更具选择性和局部化的治疗策略，在靶向肿瘤组织的同时最大限度减少全身不良反应，仍是重要的未满足临床需求。
细菌介导的癌症治疗因某些细菌种类具有选择性定植和增殖于实体瘤内的固有特性而成为有前景的治疗策略。其中，减毒鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）因其优先积聚于缺氧和免疫抑制的肿瘤区域而被广泛研究，可实现毒素、细胞因子、前药转化酶、血管生成抑制剂和肿瘤抗原等治疗分子的局部递送。肿瘤微环境的特征包括异常血管化、缺氧、坏死和免疫监视受损，为细菌持续存在和治疗活性创造了有利生态位。
细胞因子和蛋白类癌症治疗的主要局限之一在于难以在不引起全身毒性的情况下实现持续的瘤内浓度。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）和白细胞介素-2（IL-2）具有显著的抗肿瘤潜力，但其全身给药常受限于半衰期短、肿瘤选择性不足和剂量限制性不良反应。TRAIL通过死亡受体激活选择性诱导肿瘤细胞凋亡，同时保护大多数正常组织；IL-2则参与自然杀伤（NK）细胞和细胞毒性淋巴细胞等免疫效应群体的激活和扩增。然而，TRAIL介导凋亡的抵抗和抗肿瘤免疫应答激活不足限制其治疗应用，而全身性IL-2治疗常伴随严重毒性和有限的治疗定位。
TRAIL与IL-2的组合代表了一种机制互补的治疗策略，整合了直接肿瘤细胞杀伤与免疫相关抗肿瘤活性。工程化细菌载体可作为局部递送平台，在维持瘤内治疗性分子持续产生的同时最小化全身暴露。此外，缺氧响应性调控系统的整合可通过将治疗性表达限制在低氧肿瘤区域，提供额外水平的空间控制。
二、研究内容与主要技术方法
研究人员构建了表达EmGFP-TRAIL和YFP-IL-2融合蛋白的重组质粒，转化至减毒鼠伤寒沙门氏菌SL3261菌株，在缺氧条件下诱导重组蛋白表达，并通过荧光分析和ELISA验证蛋白表达。体外实验中，以HCT-8人结直肠腺癌细胞为模型，采用MTT法评估细胞毒性，Griess反应测定一氧化氮（NO）产生，流式细胞术通过Annexin V-PE/7-AAD染色分析细胞凋亡和坏死。体内实验中，将HCT-8细胞皮下接种于BALB/c裸鼠（约6周龄，SPF级，来自Biotério de Matrizes ICB/USP-SP，实验经圣卡洛斯联邦大学动物使用伦理委员会批准，协议编号9970220817），建立异种移植瘤模型，瘤内注射重组菌株，监测肿瘤生长、肿瘤重量，并通过ELISA检测血浆和腹腔灌洗液中TNF和IL-12水平，组织学分析评估肿瘤坏死，生物分布分析评估细菌在肿瘤、脾脏和肝脏中的定植情况。
三、研究结果
3.1 重组菌株的构建与治疗性蛋白表达验证
通过限制性酶切和电泳分析确认了pAE_TRAIL和pAE_IL-2表达载体的正确构建。荧光分析显示，在氧受限条件下，SL3261_TRAIL和SL3261_IL-2组较亲本SL3261菌株呈现显著增强的发射信号，确认了EmGFP-TRAIL和YFP-IL-2融合蛋白的成功表达和胞外释放。ELISA分析显示重组菌株样本中TRAIL和IL-2的吸光度信号较亲本SL3261对照增加，提供了重组蛋白产生的半定量证据。
3.2 工程化沙门氏菌来源治疗性蛋白的体外抗肿瘤活性
MTT实验显示，暴露于SL3261_TRAIL、SL3261_IL-2和SL3261_MIX上清液后，HCT-8细胞活力呈显著且时间依赖性降低。48小时后，SL3261_TRAIL组细胞活力降至约14.4%，SL3261_IL-2组从24小时的73.4%降至32.3%，SL3261_MIX组降至约23.2%。使用亲和纯化的TRAIL和IL-2蛋白进行的平行实验证实了重组蛋白的直接抗肿瘤活性，其中纯化蛋白联合处理在48小时后产生最强的细胞毒性反应，接近完全丧失代谢活性。NO测定显示，SL3261_TRAIL、SL3261_IL-2和SL3261_MIX组亚硝酸盐浓度显著增加，IL-2和MIX组NO水平最高，且NO积累与肿瘤细胞活力呈负相关。流式细胞术分析显示，SL3261_TRAIL和SL3261_IL-2处理均诱导细胞从存活状态向凋亡和坏死群体显著转变，SL3261_TRAIL增加早期和晚期凋亡群体，而SL3261_IL-2诱导涉及凋亡和坏死的更广泛细胞毒性效应。
3.3 工程化沙门氏菌菌株的体内抗肿瘤活性
瘤内给予重组菌株后14天内，所有治疗组均显著抑制肿瘤进展，SL3261_TRAIL和SL3261_MIX表现出最强的肿瘤生长抑制效果，但两组间无统计学显著差异。终点肿瘤重量方面，SL3261和SL3261_TRAIL组显著降低（p<0.01），SL3261_MIX组降低最为显著（p<0.001）。治疗期间未观察到全身性疾病或治疗相关痛苦的明显迹象。
3.4 细菌介导治疗后的细胞因子谱调节
SL3261_TRAIL和SL3261_MIX处理组血浆和腹腔灌洗液中TNF浓度较对照组显著降低。IL-12分析显示，亲本SL3261组IL-12水平较对照组升高但未达统计学显著性，而SL3261_TRAIL和SL3261_MIX处理与两个 compartments 中IL-12水平降低相关。SL3261_TRAIL与SL3261_MIX之间在TNF-α和IL-12水平上均无显著差异。
3.5 工程化沙门氏菌的优先瘤内积聚
生物分布分析显示，肿瘤组织中细菌积聚显著高于脾脏和肝脏，瘤内细菌载量达约10? CFU，而脾脏和肝脏中仅检测到极少量细菌，CFU水平显著低于肿瘤（p<0.05），证实了细菌递送系统的肿瘤靶向能力和有限的全身分布。
3.6 重组细菌治疗相关的组织病理学改变
组织学分析显示，对照组和亲本SL3261组肿瘤保留完整的肿瘤结构，仅有限局灶性坏死区域。SL3261_TRAIL和SL3261_MIX处理组肿瘤呈现广泛坏死区域，表现为细胞组织丧失、核变性和无细胞嗜酸性区域。MIX组表现出最显著的组织病理学改变，坏死区域更大且分布更广泛。
四、讨论与结论
研究人员指出，细菌介导的TRAIL和IL-2递送平台成功实现了治疗分子的局部产生，并在体外和体内均促进显著抗肿瘤效果。优先瘤内积聚支持减毒沙门氏菌递送系统的安全性特征。缺氧响应性nirB启动子的整合提供了双重靶向策略，增强治疗特异性同时最小化全身暴露。TRAIL主要通过死亡受体介导的凋亡途径发挥直接肿瘤杀伤作用，而IL-2相关处理与NO产生增加相关，提示涉及先天免疫相关机制的独特生物学反应。研究局限性包括体内实验未设置SL3261_IL-2单药治疗组，无法确定TRAIL与IL-2之间的加性或协同相互作用；BALB/c裸鼠模型限制了对T细胞介导适应性免疫应答的评估；nirB启动子的缺氧响应性诱导未在不同氧条件下直接定量。未来需在免疫功能健全或人源化肿瘤模型中开展研究，以更好地表征IL-2的贡献并确定联合治疗的协同效应。
研究结论：本研究证明了减毒鼠伤寒沙门氏菌SL3261作为结直肠癌中TRAIL和IL-2肿瘤靶向细菌递送系统的潜力。工程化菌株成功产生具有生物活性的重组蛋白，并在互补的实验方法中诱导显著抗肿瘤效果。体外实验中，重组处理降低HCT-8细胞活力并促进与TRAIL和IL-2递送相关的不同细胞毒性反应。体内实验中，SL3261_TRAIL和SL3261_MIX显著抑制肿瘤进展、减少肿瘤负担并促进广泛肿瘤坏死，证明了工程化细菌系统超越亲本菌株的治疗活性。工程化细菌在肿瘤组织中的优先积聚支持SL3261载体的肿瘤靶向行为及其局部治疗递送潜力。SL3261_MIX观察到的显著抗肿瘤活性进一步支持通过单一细菌治疗策略同时递送TRAIL和IL-2的可行性，将直接肿瘤靶向活性与能够发挥不同抗肿瘤功能的分子递送相结合。这些发现将SL3261介导的TRAIL和IL-2递送的应用扩展到结直肠癌，为工程化细菌作为实体瘤抗肿瘤分子局部递送的多功能平台提供了进一步证据。
