Nature Methods：新型显微镜平台使得大脑成像达到前所未有的深度

洛克菲勒大学的研究人员开发出一种名为三光子超深成像（TrUDI）的新型显微镜平台，并将这一成果发表在《Nature Methods》杂志上。TrUDI平台通过重新设计激光脉冲的频率和能量，以及在样本上的传输和扫描方式，将三光子成像技术推向其理论极限。

　　

当光线深入大脑时，会发生散射。目前最先进的三光子显微镜能够减少由此产生的背景荧光，理论上实现比早期技术更深的成像，但要做到这一点，它需要限制平均激光功率，这会导致过热并损伤活体组织。

洛克菲勒大学的一个研究团队并没有接受这种权衡取舍，而是从根本上重新设计了整个成像系统。他们开发出一种名为三光子超深成像（TrUDI）的新型显微镜平台，并将这一成果发表在《Nature Methods》杂志上。

TrUDI平台通过重新设计激光脉冲的频率和能量，以及在样本上的传输和扫描方式，将三光子成像技术推向其理论极限，所有这些都在样本功率暴露的安全范围内进行。

最终，成像效率提高了约250倍，这使得研究人员能够在不切除上层组织的情况下，对整个小鼠皮层进行成像，并记录深层脑区（如海马体和纹状体）的神经活动。

通讯作者、洛克菲勒大学的Alipasha Vaziri表示：“在技术领域，人们往往因历史原因而固守某种激光器或参数，大家都默认接受这些限制。”

“我们希望采取一种全新的方法。我们不预设任何前提，而是从零开始思考如何构建一个能够最大限度提升三光子成像深度的系统。结果发现，人们之前认为的限制因素其实是可以克服的。”

尽管现代显微镜可以记录活体动物大脑表层附近单个神经元的活动，但对大脑深处大范围神经元进行成像仍十分困难，因为脑组织会散射光线。随着光线向更深处传播，就无法将神经元与背景荧光区分开来。

多年来，研究人员利用精密的荧光显微镜技术不断突破这一极限。三光子显微镜是该领域最杰出的成果之一，由于其产生的背景荧光更少，因此理论上成像深度远超其他方法。然而，三光子显微镜要达到这种成像深度，仍面临着诸多限制。

“在任何多光子激发方案中，都存在一个深度极限，在此深度，背景信号和检测信号将趋于相等。理论上，对于小鼠大脑的三光子激发，这个深度极限应该在2.3毫米左右，”Vaziri谈道。“但此前实现功能性记录的最大深度约为1.2毫米。”

于是，研究团队决定从头开始重新设计成像系统。他们首先利用计算机模型确定了深度脑成像的理论极限，并明确了显微镜需要如何设计才能接近这些极限。在这些计算结果的指导下，他们对三光子显微镜的各个方面进行了优化。

值得一提的是，他们在保持平均激光功率不变的情况下，减少了激光脉冲的数量，但提高了每个脉冲的能量。此外，他们还重新设计了显微镜的聚焦和光收集方式。他们甚至开发出一种激发方案，该方案能够识别神经元，并在光束经过这些细胞时才激活激光，从而在长时间实验中将激光照射量减少高达80%。

“我们尽量避免对显微镜或激光器的参数选择做出任何临时性的假设，而是让所有参数都以最终目的为导向，即在样本安全的激光照射范围内，最大限度地提高成像深度，同时忠实地解析单个神经元的瞬态活动，”Vaziri说。

最终诞生的TrUDI平台在不增加激光功率的情况下，荧光生成效率提高了约250倍。“如果只看单个参数，一项光学调整可能只带来4-5倍的提升，这很容易被忽略，”他补充说。“但如果进行足够多的优化，那么最终性能便会突飞猛进，达到200倍的提升。”

研究团队在小鼠身上验证了这一新系统，对皮层深处乃至海马体和纹状体结构的神经元活动进行了成像，在完整的哺乳动物大脑中达到了2.1毫米的组织深度，远远超过了此前1.2毫米左右的极限。

他们还对脑组织进行分析，以检测热相关损伤及其他损伤迹象。结果表明，在研究中使用的成像条件下，未发现炎症、神经元丢失或DNA损伤的证据，证实TrUDI能够安全地达到以前被认为不适合光学成像的深度。

因此，TrUDI平台也为此前基本无法触及的大脑回路打开了一扇窗口。“纹状体的一些区域无法触及，还有一些位于更深层的脑神经核仍需要侵入性方法才能观察，”Vaziri说。“但我们的研究使这些大脑区域变得触手可及，且无需侵入性操作。”