样本固定与质谱流式细胞术在全球肿瘤临床试验中的应用：调节性T细胞监测的启示

《Bioanalysis》：Application of sample stabilization and mass cytometry in global oncology trials: lessons from regulatory T cell monitoring

引言：每年约有120万份流式细胞术标本在临床试验中处理。申办方分析调节性T细胞（regulatory T cells, Tregs）等罕见细胞群体，以显示是否发生了药效学效应。两个障碍限制了全球肿瘤临床试验中的这一应用：标本降解和检测方案开发缓慢。方法：本综述基于三个来源：已发表的整血细胞丢失数据；研究人员实验室的新鲜标本与固定标本比较；以及roginolisib首次人体剂量研究中的系列Treg测量。结果：在这些来源中，高达20%的试验样本因超出转运时间窗而被排除。采血时固定可在72小时内保持主要免疫细胞群体频率。在roginolisib研究中，系列质谱流式细胞术显示转移性葡萄膜黑色素瘤中Treg进行性减少，并与疾病控制和生存相关。结论：现场固定联合质谱流式细胞术消除了72小时运输限制。根据研究人员的经验，离散质量通道分配还可将20标志物检测方案的验证从约6个月缩短至约3周，从而支持全球肿瘤临床试验中的Treg药效学监测。关键词：临床研究；流式细胞术；质谱流式细胞术；单细胞分析；免疫监测。

1. 引言

在肿瘤学与血液学领域，全球注册的临床试验数量庞大。为提升后期试验成功率，业界日益重视基于生物标志物和药效学的早期临床信息。一项纳入824项试验的回顾性分析显示，基于生物标志物的患者选择与试验成功相关。监管机构也关注药理学标志物对剂量选择和后期开发决策的作用。由于肿瘤组织活检存在生存偏倚和异质性，外周血免疫监测被用于评估药物对免疫细胞组成的影响。流式细胞术虽广泛使用，但调节性T细胞（Tregs）等罕见群体的检测面临血液稳定性和检测方案开发两大挑战。

2. 全球临床试验中样本稳定性的挑战

静脉穿刺后标本立即开始降解，细胞活力随时间快速下降：24小时约损失15%，48小时约32%，72小时约48%。在全球多中心试验中，超过72小时转运窗的活体标本因严重活力丢失被排除，历史上最多影响20%的试验样本。即使在允许的24至72小时窗口内，不同免疫细胞群体的累积丢失程度不同，会引入噪声和偏倚，尤其影响仅占循环白细胞约2.26%的Treg等罕见群体，导致变异系数（CV）增大，干扰药效学剂量探索研究的解读。

3. 细胞术检测方案开发面临的挑战

高参数光谱流式细胞术的检测方案开发受荧光光谱重叠限制，需要溢出矩阵评估和反复优化，超过20个标志物时难度呈指数增长，临床级验证常需约6个月，难以适应早期肿瘤试验的时间要求。此外，Treg的共识表型定义依赖表面标志CD4⁺CD25⁺CD127^low；FoxP3和Helios等核内标志可进一步细化该群体，但需固定和破膜，增加传统流式的开发难度。因此，全球试验常省略这些标志物，或接受特异性较低的定义。

4. 固定和质谱流式细胞术克服稳定性和检测方案开发挑战

质谱流式细胞术采用金属同位素标记抗体，受自体荧光影响小。在采血点现场固定可终止时间依赖性细胞丢失，便于储存和批量运输。研究人员使用三步固定试剂盒（TokuKit）的经验显示，固定后样本可稳定储存并集中采集。该平台具有以下优势：

4.1 易于定制：20个以上标志物的质谱流式检测方案约3周完成验证，而光谱流式约需6个月，原因是离散质量通道只需检查邻近质量和氧化物通道干扰。

4.2 降低批次间变异：通过样本条形码（barcoding）将多个标本合并至同一批次处理，例如120个标本可分成6个条形码批次，使同批标本共享技术效应，减少独立运行所引入的标本间变异。

4.3 捕获胞内靶标：金属报告分子不受固定和破膜后自体荧光影响，可清晰检测FoxP3、Helios等核内标志；传统流式则因固定后自发荧光和散射光分辨率下降，需要额外标志物辅助设门。

4.4 参数化广度：单管可测40至50个标志物，替代多管常规流式，适合评估外周血和组织的罕见免疫亚群。

4.5 光谱流式与质谱流式的权衡：光谱流式可能具有更高的细胞回收率，但需考虑检测方案开发时间；质谱流式仪器成本与高参数光谱流式相当，主要附加设施为氩气，且已由支持多中心试验的中心实验室运行。

5. 监管考虑

5.1 免疫学命名与提交准备：高维免疫表型数据需以CDISC格式（尤其是细胞表型CP域）提交，每个设门群体需映射到受控术语（如CPTESTCD）。否则同一生物群体可能在不同研究或时间点使用不同自由文本名称，给审评和跨试验比较造成困难。

5.2 隐私：涉及欧洲中心的全球试验需符合GDPR要求，知情同意须明确检测目的，并制定合法处理、数据最小化、保存期限和跨境传输程序的文档。

5.3 实验室质量体系：若结果可能用于剂量选择、患者分层或后期标签讨论，应在CLIA认证实验室开展检测，以提供方法验证、质量控制、人员能力和熟练度测试的文档化标准，并形成从标本到数据的审计轨迹。

6. roginolisib首次人体（FiH）剂量研究案例

构象选择性PI3K-δ抑制剂roginolisib在首次人体剂量研究中，通过质谱流式细胞术在外周血和肿瘤组织均观察到Treg减少；尤其在转移性葡萄膜黑色素瘤（mUM）患者中，系列外周血检测显示Treg随时间显著减少，并与影像学评估的疾病稳定、更长的疾病控制和总生存相关。研究还发现：标准流式细胞术未能重现质谱流式所见的Treg变化，原因是Treg门内计数过低或样本在运输中超出时间窗；质谱流式的固定样本保存更好，可从容进行批量分析；细胞处理过程中的丢失可通过从每批保留参考样本予以补偿。该比较的局限包括染色程序不同（流式采用CD4⁺CD25⁺CD127^low门内FoxP3胞内染色，质谱流式仅用表面表型），且没有独立对照确定真实生物学变化。基于上述经验，相关研究团队正在多项临床试验中将质谱流式细胞术用于评估roginolisib单药或联合治疗对免疫细胞亚群（包括Treg）的影响。

6.1 结论

肿瘤异质性、活检取样偏倚及需要随时间评估免疫状态，使外周血成为可及且可重复监测的样本来源。实际路径是临床现场固定并在一个中心实验室分析，而非在每个国家运行流式样本。固定方法需通过同一次采血的新鲜与固定染色比较，以及固定标本在预期储存时间内的稳定性检查。若需在数周内完成高参数检测方案验证，质谱流式因离散通道规则而更快。每批应包含参考等分试样以识别批次差异；对于患者内变化，同一患者的系列访视样本应共享一个条形码批次。

6.2 未来展望

随着对免疫亚群作用认识的加深，早期药物研究需要广谱免疫检测；一旦确定反应模式，后续大型试验可聚焦特定亚群。类似HIV患者中CD4⁺T细胞计数指导治疗决策，外周血免疫监测有望成为标准实践。预计会出现四大变化：更短的采样间隔、检测集中化、设门自动化，以及最终取消人工设门。基于深度学习的自动化工具将辅助识别信号；人工智能（AI）来源的细胞类型若要用于临床试验终点，仍需可追溯至人类可读的CDISC式群体，以获得监管机构和申办方信任。