《Cell Cycle》：Targeting G2/M checkpoint vulnerability in homologous recombination-proficient tumors: lessons from ovarian cancer models
编辑推荐：
细胞周期失调是肿瘤的标志性特征；然而，保留同源重组（HR）功能的肿瘤仍是一项重大挑战。尽管PARP抑制剂可有效靶向HR缺陷型肿瘤，但针对BRCA1/2野生型、HR功能完好（HR-proficient）肿瘤的靶向治疗仍然有限。高级别浆液性卵巢癌中约半数病例HR功
细胞周期失调是肿瘤的标志性特征；然而，保留同源重组（HR）功能的肿瘤仍是一项重大挑战。尽管PARP抑制剂可有效靶向HR缺陷型肿瘤，但针对BRCA1/2野生型、HR功能完好（HR-proficient）肿瘤的靶向治疗仍然有限。高级别浆液性卵巢癌中约半数病例HR功能完好，这一事实表明，HR功能完好连同复制应激与检查点依赖，可能既构成一种治疗耐药机制，也构成一种对检查点偶联DNA修复的可成药依赖性。本综述综合了相关证据，即单独靶向PLK1或WEE1均可暴露这一脆弱性。PLK1与WEE1抑制涉及不同机制：PLK1抑制破坏纺锤体组装与HR能力，而WEE1抑制则放大复制应激并迫使细胞过早进入有丝分裂。然而，两者最终均汇聚于损害HR相关修复、促进未修复的DNA损伤并触发致死性有丝分裂灾难。最后，本综述讨论了未筛选生物标志物的试验失败、基于功能与复制应激的患者分层，以及与DNA损伤剂和免疫治疗的合理联合策略。
引言部分指出，精确的细胞周期调控对维持基因组完整性至关重要，其失调是肿瘤发生的决定性特征。基因组完整性的丧失通过DNA损伤反应和复制应激通路的失调促进癌症发展，为靶向这些过程提供了理论依据。细胞周期蛋白依赖性激酶4/6（CDK4/6）抑制剂在激素受体阳性、HER2阴性乳腺癌中的临床成功，为靶向细胞周期调控节点提供了先例，但G2/M轴的生物学与治疗脆弱性有所不同。与CDK4/6抑制不同，G2/M检查点抑制利用的是检查点依赖所产生的功能性脆弱性。肿瘤细胞比正常增殖组织更依赖G2/M检查点，这为选择性检查点抑制提供了潜在的治疗窗。这种依赖性在G1/S检查点控制缺陷的癌症中尤为明显。高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）中TP53突变发生率达96%。p53功能丧失损害G1/S检查点，使生存依赖转向G2/M检查点。重要的是，这种治疗脆弱性不仅限于同源重组缺陷（HR-deficient）肿瘤，还延伸至同源重组功能完好（HR-proficient）肿瘤，后者保留功能性BRCA1/2和完整的HR机制，约占HGSOC病例的50%，目前缺乏有效的靶向治疗。
在DNA修复通路转换与治疗脆弱性部分，双链断裂（DSBs）通过受细胞周期调控、在不同细胞周期时相具有不同活性和效率的通路进行修复。HR主要在S期和G2期利用姐妹染色单体作为高保真模板发挥作用。非同源末端连接（NHEJ）在不依赖同源性的情况下连接DNA末端，主要见于G1期。依赖于DNA聚合酶θ（Polθ）和短微同源序列（2–6 bp）的θ介导末端连接（TMEJ）在有丝分裂期HR和NHEJ受到显著限制时尤为重要。值得注意的是，PLK1通过直接磷酸化Polθ正向调控有丝分裂期TMEJ，使其通过与TOPBP1的BRCT7-8结构域结合而被招募至有丝分裂期DSBs。WEE1和PLK1均是G2/M期这一图景的核心整合者，尽管它们通过不同的近端机制发挥作用。WEE1通过抑制性磷酸化CDK1的Tyr15维持G2/M检查点，并通过抑制CDK活性支持HR，从而在S期和G2期维持BRCA2依赖的RAD51装载。PLK1通过激活CDC25C以及靶向WEE1和Claspin进行降解来促进检查点恢复，从而恢复CDK1活性。PLK1还通过磷酸化RAD51的Ser14促进HR，并在有丝分裂期实现Polθ依赖的TMEJ。通过不同机制协调检查点控制与DNA修复通路选择，这些激酶使细胞周期得以有序推进。因此，抑制任一激酶均可破坏检查点控制与DNA修复能力之间的协调，产生治疗脆弱性。
在HR功能完好性：从耐药机制到治疗靶点部分，PARP抑制与BRCA1/2缺陷之间合成致死关系的发现，确立了HR缺陷作为治疗靶点。然而，约50%的HGSOC患者携带野生型（WT）BRCA1/2并维持HR功能完好，传统上仅被视为一种耐药机制。作者因此提出概念性重构：当检查点相关修复功能被破坏时，HR功能完好可能代表一种情境依赖的治疗依赖性。然而，仅有HR功能完好可能无法完全解释这种脆弱性。共存的因子如Cyclin E1/CCNE1驱动的复制应激和G1/S检查点控制丧失也可能有所贡献。在作者近期的机制研究中，抑制PLK1或WEE1均可降低BRCA1/2-WT/HR功能完好卵巢癌模型中的HR相关修复能力、促进DNA损伤积累并触发有丝分裂灾难，而BRCA1/2突变/HR缺陷细胞则保持相对耐药，可能归因于代偿性DNA-PKcs依赖的NHEJ。尽管这些发现来自有限的实验模型，但支持将G2/M检查点抑制作为利用HR功能完好肿瘤中检查点依赖脆弱性的策略。本综述的范围是总结PLK1和WEE1与G2/M检查点控制及DNA修复通路选择相关联的分子机制，审视肿瘤选择性依赖与临床进展，讨论功能性生物标志物策略，并概述合理的联合方案。尽管卵巢癌是主要疾病模型，但这些概念可能适用于其他TP53改变的HR功能完好实体瘤，尚待临床验证。
关于PLK1与WEE1作为有丝分裂与DNA修复交汇处的G2/M检查点激酶，在正常增殖细胞中，PLK1表达受细胞周期严格调控，在G2期升高并于有丝分裂期达峰。相比之下，PLK1在多种人类癌症中频繁过表达，包括卵巢癌、乳腺癌、胶质瘤和肺癌，其表达升高与侵袭性临床病理特征和不良临床结局相关。除表达模式外，PLK1在有丝分裂进入和推进中发挥核心作用，对中心体成熟和纺锤体组装至关重要。PLK1还调控跨细胞周期的DNA修复通路选择：它通过磷酸化RAD51促进HR，从而促进RAD51招募和装载，并通过CDC25C激活促进检查点恢复，以及在有丝分裂期通过磷酸化Polθ激活TMEJ。总体而言，这些功能将PLK1介导的有丝分裂控制与DNA修复能力联系起来。WEE1代表一种相关但机制上不同的检查点依赖性。与PLK1类似，WEE1在卵巢癌和其他恶性肿瘤中相对于正常组织频繁表达升高。在正常细胞中，WEE1响应DNA损伤或复制应激抑制CDK1/2活性，从而防止过早进入有丝分裂。机制上，WEE1在S期限CDK2活性，从而抑制计划外的复制起点激活，并在G2/M转换时抑制CDK1以维持检查点控制。在肿瘤细胞中，WEE1成为关键的应激缓冲依赖性，尤其是当G1/S检查点控制受损时。这种依赖在TP53突变或Cyclin E1升高的肿瘤中尤为显著，这些肿瘤不成比例地依赖G2/M检查点控制。在化疗后卵巢癌中，高WEE1表达预示不良生存。在HGSOC中，CCNE1扩增或Cyclin E1过表达尤其相关，因为它增强CDK2驱动的复制应激，并常与HR功能完好疾病相关。WEE1通过在S期和G2期维持HR蛋白组装所需的CDK活性水平，来维持BRCA2依赖的RAD51装载。近期在裂殖酵母中的研究揭示，Wee1独立于Cdc2（裂殖酵母CDK1直系同源物）Tyr15磷酸化，对动粒-微管稳定性有所贡献。Wee1缺陷的裂殖酵母细胞表现出动粒-微管附着缺陷和染色体双向定向受损，导致组成性纺锤体组装检查点激活。这些发现提出了哺乳动物细胞中WEE1抑制可能通过检查点废除之外的机制损害纺锤体完整性的可能性；然而，这一酵母特异性观察在哺乳动物癌细胞中的相关性仍有待确立，且该机制尚未在卵巢癌模型中直接检验。
在PLK1与WEE1的趋同与分歧部分，尽管PLK1和WEE1通过不同的上游机制发挥作用，但在所检测的HR功能完好模型中，抑制任一激酶均可产生重叠的下游表型，包括HR相关修复受损、DNA损伤积累和有丝分裂灾难。这种趋同不应被视为共享或可互换分子机制的证据；相反，PLK1或WEE1抑制破坏不同的上游节点，导致重叠的下游表型。这一区别对生物标志物开发尤为重要：Cyclin E1/CCNE1状态通过CDK2驱动的复制应激与WEE1抑制剂敏感性有直接机制联系，而将Cyclin E1与PLK1抑制剂敏感性联系起来的分子基础仍不清楚。
在机制框架：HR功能完好性作为治疗脆弱性部分，核心假设指出，在有限数量的实验系统中展示的关键发现是，BRCA1/2-WT/HR功能完好卵巢癌细胞对PLK1或WEE1抑制的敏感性显著高于BRCA1/2突变/HR缺陷细胞。在所检测的模型中，HR功能完好细胞依赖检查点偶联的HR和有序的有丝分裂进程。WEE1抑制促进带有未修复DNA损伤的过早有丝分裂进入，而PLK1抑制引起纺锤体缺陷和有丝分裂阻滞，两者均与HR相关修复减少相关。相比之下，BRCA1/2突变/HR缺陷细胞表现出相对耐药，可能归因于代偿性DNA-PKcs依赖的NHEJ。然而，HR状态与WEE1抑制剂敏感性之间的关系可能在不同实验系统中有所变化。在一项使用HGSOC细胞的独立研究中，adavosertib活性与HR状态无关。因此，仅有HR功能完好可能不是WEE1抑制反应的稳健生物标志物。相反，它可能代表更广泛脆弱状态的一个组成部分，该状态包括复制应激、Cyclin E1/CCNE1失调和G1/S检查点功能丧失，尽管这些因素的相对贡献仍不清楚。在此框架内，有丝分裂灾难代表检查点破坏的突出后果。它由存在未修复DNA损伤或纺锤体缺陷时的异常有丝分裂所启动，最终导致细胞死亡或不可逆阻滞。此外，取决于复制应激、DNA损伤和有丝分裂扰动的程度和时机，PLK1或WEE1抑制可诱导复制灾难、凋亡、衰老、微核形成和先天免疫信号激活，这些可能共同促成其抗肿瘤效应。
在PLK1抑制：纺锤体组装缺陷与HR相关修复受损部分，Volasertib（BI 6727）作为一种选择性PLK1抑制剂，诱导显著的纺锤体组装缺陷。在BRCA1/2-WT细胞中，PLK1抑制触发M期蓄积和有丝分裂阻滞，与纺锤体组织破坏一致。关键的是，volasertib显著减少BRCA1/2-WT细胞中RAD51 foci形成，与HR相关修复受损一致。由于RAD51 foci形成具有细胞周期依赖性，这一发现理想情况下应结合S/G2期细胞比例进行解读，而作者此前的研究未专门评估这一点。RAD51 foci的减少可能部分反映细胞周期分布的同步变化和PLK1抑制诱导的有丝分裂阻滞，而非必然表明HR活性直接受抑。因此，通常在S/G2期通过HR修复的DNA损伤可能持续未修复进入缺陷的有丝分裂，纺锤体组装失败和HR相关修复减少可能汇聚促进有丝分裂灾难。
在WEE1抑制：复制应激放大与检查点废除部分，Adavosertib（MK-1775/AZD1775）作为一种WEE1抑制剂，通过不同机制发挥作用：它废除G2/M检查点，迫使细胞在DNA损伤未解决前过早进入有丝分裂。WEE1抑制升高CDK1和CDK2活性，放大复制应激并干扰BRCA2依赖的RAD51装载。在作者的BRCA1/2-WT卵巢癌模型中，adavosertib减少RAD51 foci并增加γH2AX，与DNA损伤增加背景下HR相关修复受损一致；前述细胞周期注意事项同样适用于此发现。通过同时增加DNA损伤负荷和损害HR相关修复，WEE1抑制可能驱动HR功能完好细胞走向有丝分裂灾难。
在代偿性NHEJ与DNA-PKcs合成致死部分，BRCA1/2突变细胞在作者模型中对PLK1或WEE1抑制表现出低敏感性，可能至少部分反映代偿性DNA-PKcs依赖的NHEJ。在实验条件下，这些细胞主要发生有丝分裂阻滞而非细胞死亡。支持这一代偿机制的证据来自小干扰RNA（siRNA）敲低或药理学抑制DNA-PKcs（NU7441）后BRCA1/2突变细胞敏感性的恢复。然而，HR缺陷细胞在PLK1或WEE1抑制后优先依赖DNA-PKcs依赖的NHEJ这一更广泛命题，代表的是对该合成致死结果的机制性解读，而非直接证明的普遍原则。PLK1依赖的TMEJ是否促成了HR功能完好与HR缺陷细胞对PLK1抑制的差异敏感性仍未知，且未在本文讨论的模型中检测。这些发现支持一个模型：HR功能完好细胞依赖检查点偶联的HR，而HR缺陷细胞通过代偿性DNA-PKcs依赖的NHEJ存活。
在PLK1与WEE1抑制剂的临床开发部分，PLK1抑制剂通常显示 modest 或不确定的疗效，而WEE1抑制剂在生物标志物筛选人群中显示了 consistent 的临床活性。Cyclin E1蛋白过表达已成为WEE1抑制剂敏感性有前景的预测性生物标志物。PLK1抑制剂已证明 strong 的临床前活性但临床成功有限，反映了机制理解与有效转化之间的脱节。Volasertib在早期研究中显示活性，但在铂耐药卵巢癌中未能证明与化疗相比的无进展生存优势，且与显著血液学毒性相关。这种有限的临床疗效可能反映若干因素，包括缺乏生物标志物驱动的患者选择、与增殖正常组织（特别是造血细胞）中靶向毒性相关的窄治疗窗，以及内在或获得性耐药机制。在一项关键性III期急性髓系白血病（AML）试验中，volasertib联合低剂量阿糖胞苷与致死性不良事件和早期死亡率增加相关，特别是骨髓抑制相关感染，可能抵消其临床获益。近期，onvansertib显示了令人鼓舞的临床前和临床活性。在KRAS突变转移性结直肠癌中，onvansertib联合FOLFIRI和贝伐珠单抗的总体缓解率为26.4%；在贝伐珠单抗初治患者的探索性亚组中为76.9%。因此，PLK1抑制的临床潜力可能取决于疾病背景、合理联合和生物标志物指导的患者选择。尽管积累的临床前证据支持分子分层，但PLK1抑制剂的生物标志物驱动临床试验仍然稀少。临床前研究已确定PLK1抑制的若干潜在耐药机制，包括PLK1 ATP结合域突变和AML细胞中MDR1表达增加，以及黑色素瘤模型中线粒体蛋白表达特征改变。这些机制尚未在卵巢癌中得到验证。这与WEE1抑制剂开发形成对比，后者从相对早期阶段就将Cyclin E1/CCNE1-high富集纳入临床开发，导致Cyclin E1与WEE1抑制剂敏感性之间关联获得更强的临床支持。将Cyclin E1与PLK1抑制剂敏感性联系起来的临床项目仍然有限，这种开发历史的差异可能部分解释了两个靶点之间当前证据水平的差距。
相比之下，WEE1抑制已证明 modest 但可重复的临床活性。p53缺陷或复制应激升高的肿瘤表现出对G2/M检查点功能的高度依赖。Cyclin E1过表达已成为卵巢癌中有前景的预测性生物标志物。一项随机II期试验证明adavosertib联合吉西他滨改善了铂耐药卵巢癌的无进展生存，其他研究报道了其在TP53突变、铂耐药背景下联合卡铂的活性。这种活性也在CCNE1扩增肿瘤中观察到。然而，WEE1抑制剂疗效的决定因素仍不完全清楚。单药反应 modest，反映了对实践中不一致识别的特定分子背景的依赖。尽管许多联合策略基于机制原理被开发，但生物标志物指导的患者选择尚未系统性地纳入大多数临床试验，且重叠毒性可能限制剂量强度。临床前研究已确定WEE1抑制的潜在耐药机制，包括PKMYT1（Myt1）的代偿性上调（其独立于WEE1维持抑制性CDK1磷酸化），以及作为复制应激适应性反应的雷帕霉素机制靶点（mTOR）通路激活。近期临床进展越来越多采用生物标志物驱动的试验设计，特别是基于Cyclin E1状态的设计。总体而言，这些发现支持聚焦于生物学定义目标人群的WEE1抑制临床开发策略。正在进行的III期ASPENOVA试验正在评估azenosertib单药对照研究者选择化疗（紫杉醇、聚乙二醇脂质体多柔比星、吉西他滨或拓扑替康）在Cyclin E1阳性、铂耐药卵巢癌患者中的疗效。通过将入组限制在这一生物标志物定义的亚组，该试验设计直接解决了上述患者选择局限性。
在生物标志物开发与临床转化部分，PLK1和WEE1抑制剂的临床经验表明，需要从静态基因组分层转向捕捉当前DNA修复能力和复制应激的功能性生物标志物。当前卵巢癌中基于HR缺陷（HRD）的分层依赖基因组不稳定性疤痕检测（杂合性缺失、端粒失衡和大规模状态转换），其预测PARP抑制剂反应但反映的是历史而非当前HR修复状态。HR状态本质上是动态的；BRCA1/2突变肿瘤可获得BRCA1/2回复突变或53BP1/Shieldin缺失，恢复HR功能并赋予耐药。相反，复制应激和检查点扰动在治疗阶段动态调节HR活性。检查点激酶抑制本身可能短暂损害原本HR功能完好肿瘤中的HR，可能赋予PARP抑制剂敏感性。这些动态表明HR状态并非固定而是演变的，推动了下文描述的功能性生物标志物方法。因此，基因组HRD状态与功能性HR评估之间的不一致可能识别具有恢复HR活性的肿瘤。肿瘤可能保留历史基因组HRD疤痕而显示保留的RAD51 foci形成，这与当前HR功能完好一致。然而，功能检测 alone 无法确定HR恢复的机制，如BRCA1/2回复突变，这需要互补的分子分析。为此已开发两种互补的功能性方法。第一，RAD51 foci形成提供当前HR能力的功能性读数，可区分HR缺陷与HR功能完好肿瘤。在迄今报道的方法中，它最接近捕捉这种实时修复能力，尽管尚未确立为常规临床检测。由于RAD51 foci主要在S/G2期细胞中形成，解读应考虑增殖并优选在geminin阳性肿瘤细胞中量化RAD51 foci。同时评估DNA损伤如γH2AX可帮助确认RAD51 foci减少反映修复受损而非损伤诱导不足。检测阈值和评分方法必须标准化。第二，基于基因组和分子替代物的复制应激分层，包括CCNE1扩增/过表达、RB1或MYC失调和Cyclin E1/CDK2激活，与检查点激酶抑制反应相关。使用磷酸化RPA2（p-RPA2）免疫荧光在福尔马林固定石蜡包埋标本中的功能评估（尚未成为常规临床检测）进一步分层HR功能完好肿瘤并预测铂类和PARP抑制剂反应。作者根据生物学、临床前和临床证据水平将生物标志物成熟度分类为探索性、临床前验证或临床可操作。在此框架内，Cyclin E1是WEE1抑制最临床先进的生物标志物，在生物标志物指导的临床开发背景下被归类为临床可操作，得到基于免疫组化（IHC）评估可行性和临床富集策略的支持。RAD51 foci和p-RPA2仍为探索性，有待进一步验证和检测标准化。对于PLK1抑制，目前尚无临床确立的生物标志物；然而，HR功能完好和Cyclin E1升高仍是临床前验证支持的候选生物标志物。Cyclin E1/CCNE1状态、RAD51 foci形成和p-RPA2表达的组合并非构成即用型临床生物标志物面板，而是为患者分层提供了合理的转化框架。Cyclin E1的临床评估得到临床级IHC检测可重复性（阳性状态病理学家间一致性90%）和HGSOC队列中Cyclin E1过表达高患病率（约59%）的支持，其中超过半数缺乏CCNE1扩增。在将这种整合方法纳入临床决策之前，需要进一步的前瞻性研究整合功能性和基因组生物标志物。
在联合策略部分，两种合理联合方法值得进一步临床研究。第一，将检查点激酶抑制剂与常规DNA损伤剂联合可能进一步增强治疗疗效。吉西他滨、卡铂和拓扑异构酶抑制剂增加DNA损伤和复制应激。抑制PLK1或WEE1可能通过放大复制应激和/或阻止检查点介导的恢复进一步增加DNA损伤后果，从而增强细胞毒性。Adavosertib联合吉西他滨和卡铂的临床获益已得到证明，尽管其在未选择患者人群中的疗效仍有限。第二，检查点激酶抑制剂可与免疫治疗联合。WEE1抑制已被报道通过卵巢癌模型中内源性逆转录病毒（ERV）/双链RNA介导的干扰素反应激活先天免疫信号，并已在与程序性死亡配体1阻断联合中证明临床前活性。相比之下，WEE1相关cGAS-STING激活和PLK1诱导免疫原性细胞死亡证据主要来自非卵巢临床前模型。检查点激酶抑制剂/免疫治疗联合用于卵巢癌的临床验证尚不可用。此外，由于重叠毒性可能限制同时治疗，还应考虑序贯或间歇给药方案。增殖肿瘤细胞和正常细胞对检查点激酶抑制的差异敏感性可能至少部分源于检查点依赖性的差异。与许多TP53改变肿瘤细胞相比，正常增殖细胞通常保留相对完整的G1/S检查点控制，因此可能较少依赖G2/M检查点功能，为治疗窗提供了部分分子基础。然而，由于PLK1和WEE1也调控正常增殖细胞中必需的有丝分裂和复制过程，这一窗口本质上是有限的，特别是在快速更新的组织如造血和胃肠道 compartment 中。这在临床上反映为PLK1和WEE1抑制剂观察到的血液学和胃肠道毒性。在更广泛临床实施之前，需要前瞻性研究来确定疗效、毒性、最佳给药方案和生物标志物定义的肿瘤背景。
在未来展望与结论部分，BRCA1/2-WT和HR功能完好肿瘤在临床上仍具挑战性，因为与BRCA1/2突变肿瘤不同，它们保留足够的DNA修复能力以耐受PARP抑制剂和其他DNA损伤导向治疗。本文讨论的证据表明，这种修复能力可能与完整的检查点调控以及复制应激和Cyclin E1升高等共存特征相关，这些共同促成治疗脆弱性。PLK1和WEE1在G2/M检查点轴内提供机制上不同的方法，通过破坏检查点控制和HR相关修复。PLK1抑制诱导纺锤体组装缺陷，而WEE1抑制放大复制应激并促进过早有丝分裂进入。尽管上游机制不同，两者均可限制HR功能完好肿瘤细胞的代偿能力，从而促进有丝分裂灾难和细胞死亡。这种趋同性破坏可能促成所报道HR功能完好模型中选择性活性的观察。然而，临床转化需要更好地将分子背景整合到试验设计中。HR能力和持续复制应激的功能性生物标志物（RAD51 foci和p-RPA2），连同复制应激易感性的分子替代物（Cyclin E1过表达），应前瞻性评估用于患者选择。此外，合理的给药方案和生物标志物指导的联合对于最大化疗效和限制毒性很重要。未来临床开发应在考虑PLK1和WEE1抑制不同药理学后果的同时，保持G2/M检查点脆弱性的共享框架。由于最佳治疗 schedule、联合伙伴和剂量限制性毒性不太可能相同，需要药物特异性试验设计。富集生物标志物的早期研究，在可行时将Cyclin E1/CCNE1状态与配对标本中RAD51 foci或复制应激标志物的药效学评估相结合，可能有助于识别检查点抑制产生预期HR功能损害的肿瘤。最终，靶向维持HR功能完好的机制而非仅聚焦于HR缺陷，可能为这一临床挑战性肿瘤人群提供有前景的治疗途径。
