氧化应激靶向干预减轻高脂血症细胞与动物模型中的血管纤维化

《Antioxidants》：Targeting Oxidative Stress Attenuates Vascular Fibrosis in Cellular and Animal Models of Hyperlipidemia

摘要专业翻译 高脂血症相关动脉粥样硬化促进斑块形成和血管中膜细胞外基质积聚，同时增加活性氧（ROS）的产生、炎症以及低密度脂蛋白（LDL）向氧化型LDL（oxLDL）的氧化，其机制尚不明确。本研究旨在确定oxLDL诱导的氧化应激是否驱动动脉粥样硬化过程中动脉中膜的纤维化，以及抗氧化剂能否预防或减轻这一效应。实验在血管平滑肌细胞（VSMCs）和载脂蛋白E基因敲除（KO-apoE）小鼠中进行。ROS产生通过共聚焦显微镜检测，纤维化在VSMCs中通过免疫荧光、Western blot和RT-qPCR检测，在小鼠中通过天狼星红染色和RT-qPCR检测。在VSMCs中，oxLDL处理显著增加了转化生长因子-β（TGF-β）、纤连蛋白（FN）和I型胶原蛋白（Col I）的表达，表明纤维化发生。此外，oxLDL增强了ROS产生和NF-κB激活。抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）和NF-κB抑制剂处理可阻止纤维化反应，提示ROS-NF-κB轴介导了VSMCs中的这些效应。在体内，与野生型对照相比，KO-apoE小鼠表现出更高的胆固醇水平和增加的ROS产生，这些小鼠还表现出增强的主动脉纤维化。重要的是，NAC给药降低了KO-apoE小鼠的ROS产生和纤维化。总体而言，研究结果表明oxLDL诱导的血管纤维化和高脂血症诱导的纤维化均由ROS介导。

论文解读文章

一、研究背景与目的

心血管疾病（CVD）是全球范围内导致疾病和残疾的首要原因，其许多主要形式如心肌梗死、卒中和外周血管疾病的根本病理过程是动脉粥样硬化。动脉粥样硬化影响大动脉，以炎症、脂质积聚、血管平滑肌细胞（VSMCs）增殖、细胞死亡和纤维化为特征。动脉粥样硬化的发展始于内皮通透性增加，导致内皮功能障碍，使胆固醇和低密度脂蛋白（LDL）渗入血管壁并与蛋白聚糖结合后被氧化。高循环水平的LDL导致高脂血症，被认为是动脉粥样硬化的主要危险因素。LDL被巨噬细胞摄取并氧化成为氧化型LDL（oxLDL），oxLDL通过诱导活性氧（ROS）产生，在动脉粥样硬化的发展中发挥关键作用。ROS产生增加伴随抗氧化防御能力下降，破坏生理平衡，产生氧化应激。氧化应激与纤维化密切相关：ROS可诱导并激活转化生长因子-β（TGF-β），而TGF-β在激活纤维化通路中起关键作用。纤维化指异常伤口愈合导致的细胞外基质（ECM）过度积聚，表现为组织僵硬、苍白和缺乏弹性。在心血管疾病中，ECM改变涉及多种疾病状态，动脉僵硬已被确认为糖尿病、高血压、动脉疾病和卒中患者心血管死亡的独立预测因子。

然而，动脉粥样硬化过程中动脉中膜纤维化发展的机制，特别是与高脂血症和氧化应激相关的机制，仍不完全清楚。因此，本研究旨在探究oxLDL诱导的氧化应激是否促进动脉粥样硬化过程中动脉中膜的纤维化发展，以及抗氧化治疗能否预防或减轻这一过程。研究采用两个互补的实验模型：人VSMCs用于体外研究（VSMCs是动脉中膜的主要细胞类型），以及载脂蛋白E基因敲除（KO-apoE）小鼠用于体内研究（该模型能较好地再现人类动脉粥样硬化的关键特征）。

二、主要关键技术方法

研究人员采用了以下关键技术方法：体外实验使用人血管平滑肌细胞（VSMCs），该细胞来源于五名无心血管代谢疾病或危险因素的器官捐献者主动脉的酶消化分离，由马德里自治大学的Peiró博士和Sánchez-Ferrer博士提供。LDL经CuSO₄氧化48小时制备oxLDL，并通过非变性电泳和TBARS实验验证氧化程度。VSMCs以oxLDL 50 μg/mL处理不同时间，使用免疫荧光、Western blot和RT-qPCR检测纤维化相关蛋白和mRNA表达；使用CellROX和DHE荧光探针结合共聚焦显微镜检测ROS产生；使用电泳迁移率变动实验（EMSA）分析NF-κB与FN启动子的结合。体内实验使用12月龄雄性C57BL6小鼠，包括野生型（WT，n=20）和KO-apoE小鼠（n=20），每组各半（n=10）在处死前最后12周通过饮水给予NAC（5 g/L）。检测血清胆固醇、血压、主动脉天狼星红染色评估纤维化、DHE探针检测ROS、免疫组化检测血红素加氧酶-1（HO-1）、RT-qPCR检测FN、Col I、Nrf2和Gpx1的mRNA表达。

三、研究结果

3.1 oxLDL通过ROS产生诱导血管平滑肌细胞纤维化

VSMCs经oxLDL 50 μg/mL处理后，FN和Col I的表达呈时间依赖性增加，免疫荧光显示最大效应出现在8小时。Western blot和RT-qPCR进一步证实了FN和Col I蛋白及mRNA表达的时间依赖性增加。TGF-β的表达在8小时显著增加，Western blot证实其时间依赖性上调。同时，TGF-β信号通路组分Smad2/3的磷酸化水平也受到oxLDL的诱导。ROS检测显示，oxLDL在30至60分钟暴露期间诱导ROS产生显著增加。抗氧化剂NAC（100 μM）几乎完全阻止了oxLDL诱导的纤维化，降低了FN、Col I和TGF-β的表达。

3.2 oxLDL诱导的氧化应激通过NF-κB促进血管平滑肌细胞血管纤维化

EMSA实验显示，oxLDL诱导NF-κB与FN启动子的结合呈时间依赖性增加，表明oxLDL诱导的FN表达可能由NF-κB激活介导。该效应具有特异性，因为当核提取物与过量未标记NF-κB DNA或NF-κB特异性抗体孵育时，结合消失。NAC预处理阻止了oxLDL诱导的NF-κB与FN启动子的结合，提示oxLDL对血管纤维化的效应可能通过ROS产生介导NF-κB激活。使用NF-κB激活抑制剂QNZ（50 nM）后，oxLDL无法增加FN或Col I的表达，进一步证实了该机制。

3.3 NAC治疗预防KO-apoE小鼠血管氧化应激

KO-apoE小鼠的胆固醇水平显著高于WT小鼠，符合动脉粥样硬化和高脂血症模型特征，但NAC治疗不改变任一组的胆固醇水平。各组间血压无显著差异。DHE荧光探针检测显示，KO-apoE小鼠主动脉中膜全层的ROS表达高于WT小鼠，而NAC治疗有效降低了ROS水平。RT-qPCR检测显示KO-apoE小鼠主动脉Nrf2表达增加，可能是对氧化应激的代偿反应；NAC治疗显著降低了KO-apoE小鼠的Nrf2表达，可能归因于氧化应激的降低。然而，谷胱甘肽过氧化物酶-1（Gpx1）和血红素加氧酶-1（HO-1）的表达在各组间无显著变化，提示存在抗氧化反应受损或不足的情况。

3.4 NAC治疗改善KO-apoE小鼠血管纤维化且不依赖胆固醇水平

天狼星红染色显示，KO-apoE小鼠主动脉中膜纤维化明显增加，而NAC治疗的KO-apoE小鼠纤维化显著减少。RT-qPCR分析进一步证实，KO-apoE小鼠的FN和Col I mRNA水平均升高，而NAC治疗小鼠的这些水平显著降低。这些结果表明，氧化应激似乎是高胆固醇血症和动脉粥样硬化模型中血管纤维化的原因，因为NAC治疗虽不降低胆固醇水平，但能预防氧化应激增加带来的后果。

四、讨论与结论总结

研究讨论指出，oxLDL在VSMCs中诱导了明确的促纤维化反应，表现为FN和Col I表达增加以及TGF-β上调。促纤维化反应先于ROS的快速增加，并被抗氧化剂NAC显著减弱，表明氧化应激是纤维化反应的关键因素。研究发现oxLDL通过ROS依赖的NF-κB激活机制促进VSMCs的促纤维化表型，NF-κB直接结合FN启动子并介导oxLDL诱导的促纤维化标志物表达。体内实验中，KO-apoE小鼠表现出明显的血管纤维化，主要定位于中膜的VSMCs，同时检测到主动脉组织氧化应激增加，与体外结果高度一致。NAC治疗显著降低了氧化应激和纤维化，但不改变循环胆固醇水平。KO-apoE小鼠Nrf2表达增加但抗氧化酶Gpx-1和HO-1无变化，提示抗氧化下游反应受损或不足。

研究结论：研究结果支持oxLDL诱导的氧化应激在血管纤维化发展中的作用。在培养的VSMCs中，oxLDL通过激活ROS/NF-κB通路和增加TGF-β表达促进细胞外基质积聚。与此一致，KO-apoE小鼠表现出主动脉中膜血管纤维化伴随氧化应激增加，支持体外鉴定机制的生理相关性。此外，抗氧化剂NAC在体外和体内均有效减少氧化应激和纤维化重塑，凸显了基于抗氧化策略作为限制动脉粥样硬化相关血管重塑治疗方法的潜在价值。