基于标准LED的差分强度SPR成像：用于无标记自噬监测的高通量低成本生物传感器

《Biosensors》：Differential Intensity SPR Imaging with Standard LEDs: A High-Throughput, Low-Cost Biosensor for Label-Free Autophagy Monitoring

　　

表面等离子体共振成像（SPRi）是一种用于生物分子相互作用分析的有力无标记技术，然而传统的基于强度的SPRi系统受限于有限的折射率分辨率和昂贵的光源。本研究提出了一种基于差分强度检测算法与标准LED照明的高通量、低成本SPRi生物传感器。通过在730 nm和780 nm处探测共振凹陷两侧翼上相反的反射率变化并取其差值，该方案抵消了共模噪声，同时将灵敏度提升至多2.6倍。具体而言，差分信号按像素计算为在730 nm和780 nm LED下获取的两幅反射率图像之差，I_D = I₇₃₀ ? I₇₈₀，从而使两侧翼上符号相反的响应相加，而共模强度波动被减去。该系统仅采用三个标准LED、一个六通道流通池和单个CMOS相机，光源成本低于200美元。实现了1.03 × 10⁴灰度值/折射率单位（RIU）的灵敏度、优异的线性（R² = 0.9989）以及1.9 × 10^?6 RIU的分辨率。作为概念验证，该生物传感器被应用于使用小分子抑制剂DC-LC3in-D5作为探针，对A549肺癌细胞裂解物中自噬相关LC3B积累进行无标记监测。SPRi响应显示出与流式细胞术和Western blotting完全一致的剂量依赖性趋势。得益于其高通量能力、低成本和无抗体读出，该平台在评估抗癌药物治疗后自噬介导的治疗耐药性方面具有潜力。

研究背景方面，自噬是一种高度保守的分解代谢过程，在癌症背景下促进肿瘤进展、免疫逃逸和治疗耐药。微管相关蛋白轻链3B（LC3B）脂化为其自噬体结合形式LC3B-II反映自噬体形成，是自噬途径的关键执行者，药物处理条件下常伴随总LC3B蛋白升高，因此准确及时检测LC3B积累对于理解自噬调控和评估自噬调节抗癌药物疗效至关重要。常规自噬检测方法包括流式细胞术、Western blotting、免疫染色和透射电子显微镜，存在周转时间长、成本高和抗体依赖等问题。近年来特异性识别LC3B的小分子探针作为抗体替代品出现，为无标记检测自噬提供了可能，但尚缺乏能将此类分子探针与快速、并行、低成本读出相结合的检测平台。表面等离子体共振（SPR）传感是一种成熟的无标记技术，可实时监测生物分子相互作用；其中强度询问型SPR成像（SPRi）系统架构最简单，无需机械扫描、光谱仪或干涉组件，但强度询问的简洁性以性能为代价，易受共模噪声如光源强度波动和温度漂移影响，折射率分辨率（RIR）限于10^?6–10^?5 RIU量级。双波长差分检测虽被提出以抵消共模噪声，但现有系统仍依赖激光二极管、声光可调滤波器或双相机配置等昂贵组件，且与商用光源兼容的系统性波长选择策略鲜有研究。基于此，研究人员开发了一种通过优化激发波长和入射角实现高灵敏度的简化SPRi生物传感器，设计了基于SPR光谱响应系统分析的差分强度检测算法，采用730、756和780 nm三个标准LED作为光源，其中两个构成差分探测对，第三个用于设定入射角。该系统以报道的强度型SPRi系统中最低的硬件成本实现了1.9 × 10^?6 RIU的竞争力的RIR及六通道并行检测能力，并通过检测分析癌细胞裂解物中LC3B积累验证了其无标记、高通量性能，可用于在分子水平监测和评估抗癌药物治疗诱导的自噬调节。

关键技术方法方面，研究人员采用SF11棱镜（折射率1.785 RIU）耦合的Kretschmann构型，在金膜（约48 nm）传感器芯片上激发SPR；光源模块由三个独立可控标准LED（中心波长730、756、780 nm）、聚光镜、1 mm针孔和准直镜组成；反射光经集成p偏振偏振片的成像透镜成像于CMOS相机；采用六通道流通池实现并行检测；通过角扫描将756 nm设定于共振凹陷底部以固定入射角；以差分信号I_D = I_L ? I_R进行像素级计算；生物验证使用A549人肺腺癌细胞系（购自上海富衡生物技术有限公司），以顺铂（10 μM）联合雷帕霉素（0.1 μM和1 μM）处理24 h诱导自噬，并以DC-LC3in-D5（1.25 μM）通过物理吸附固定于金表面作为分子探针，另以流式细胞术（Cyto-ID染色）和Western blotting作为对照验证。

研究结果方面，差分强度检测算法原理部分通过模拟1.330至1.339 RIU折射率范围内的SPR反射光谱，得出折射率增加导致共振凹陷红移、左侧探测波长反射率单调增加而右侧单调减少的规律；分析偏离共振波长?50至+50 nm处的反射率变化，发现左侧在?30 nm偏移处灵敏度最高达69.2%/RIU，右侧在+35至+40 nm偏移处最高达48.6%/RIU；差分信号随折射率线性增加，灵敏度为108.9%/RIU，分别为单侧信号I_L（66.9%/RIU）和I_R（42.0%/RIU）的1.6倍和2.6倍，且共模噪声在相减中被抵消。基于两侧响应不对称性，以差分灵敏度为品质因数，?30和+35 nm偏移组合给出最高值117.8%/RIU，但考虑标准LED成本与光谱可控性，选择730、756和780 nm三个标准LED，其与最优偏移的偏差仅使差分灵敏度从117.8降至108.9%/RIU，损失仅7.6%。SPRi系统折射率分辨率部分，通过0至0.5%梯度NaCl溶液（折射率增量1.85 × 10^?4 RIU）单通道测试观察到稳定阶梯式响应，六通道并行测试中差分信号较任一侧信号显著放大，线性拟合得R² = 0.9989、灵敏度1.03 × 10⁴ a.u./RIU；纯水中30 min记录的均方根（RMS）噪声为0.02 a.u.，据公式得RIR为1.9 × 10^?6 RIU；与已报道强度型SPRi系统比较，该系统仅用三个标准LED、无波长选择或机械切换组件，同时实现竞争力的RIR、六通道高通量和最低硬件成本，光源模块总成本低于200美元。A549细胞裂解物中自噬相关LC3B积累的SPRi检测部分，以顺铂联合雷帕霉素处理建立自噬活性排序（Control < Cis-Rapa-L < Cis-Rapa-H），流式细胞术显示Cyto-ID平均荧光强度递增，Western blotting显示LC3B-I和LC3B-II呈剂量依赖性升高且p62/SQSTM1（62 kDa）显著降解，确立对照基准；SPRi实时响应显示Cis-Rapa-H和Cis-Rapa-L组信号快速上升后趋于饱和、冲洗后稳定于特异性捕获水平，而Control、Blank和Without-DC-LC3in-D5组全程基本处于基线，证实响应源于DC-LC3in-D5与LC3B的特异性结合；三次独立实验响应幅值分别为Cis-Rapa-H组1.72 ± 0.14、Cis-Rapa-L组1.15 ± 0.17、Control组0.03 ± 0.11、Blank组0.15 ± 0.17和Without-DC-LC3in-D5组0.00 ± 0.08 a.u.，Cis-Rapa-H组为Cis-Rapa-L组的1.5倍，呈清晰剂量依赖性并与流式细胞术和Western blotting趋势一致，Control组响应低于药物处理组与其较低总LC3B水平相符；由于DC-LC3in-D5结合LC3B-I和LC3B-II，SPRi信号反映总捕获LC3B。与需特定抗体、流程冗长和 skilled操作的Western blotting相比，该SPRi方法以无标记、无抗体方式检测自噬标志物，样品消耗微量、试剂成本低，结合六通道并行检测能力，有望用于自噬调节药物候选物的快速高通量筛选。

讨论部分总结了该研究的优势与局限。优势在于：所提出的差分强度检测算法结合简单LED照明，在灵敏度、通量和成本之间取得优异平衡，特别适合高通量、低成本生化传感应用；该平台以无标记、无抗体和并行检测能力，在自噬调节药物候选物快速高通量筛选方面具有广阔前景；未来工作将聚焦于扩展通道数、整合微流控样品处理和将该平台应用于临床样本耐药性筛选。局限性包括：第一，由于使用固定中心波长的标准LED，探测波长无法像AOTF系统那样连续调谐，可实现的差分灵敏度受可用LED波长及其有限光谱带宽（FWHM ≈ 20–30 nm）限制，两探测带间存在轻微光谱重叠；第二，系统依赖被动热稳定性，尽管差分算法抑制共模温度诱导的强度漂移，但缺乏主动温度控制限制了长期稳定性，超过数十分钟的测量需进行基线漂移校正；第三，探针DC-LC3in-D5通过物理吸附固定于平面金膜，可能导致探针逐渐浸出，限制芯片再生和重复使用，且不如共价固定化学稳定；第四，该平台迄今仅在受控条件下用细胞裂解物验证，其在复杂临床样本中的性能尚待证明；解决这些局限——例如采用温度稳定LED光源、共价探针固定和集成微流控——将是未来工作的重点。研究结论部分翻译如下：本工作提出了一种基于差分强度检测算法与标准LED照明的高通量、低成本SPR成像生物传感器。通过探测SPR共振凹陷两侧翼上相反的反射率变化并取差值，该方案抵消共模噪声同时大幅增强强度响应。系统仅采用三个标准LED、一个六通道流通池和单个CMOS相机，无任何波长选择或机械切换组件。实验结果表明灵敏度为1.03 × 10⁴ a.u./RIU、线性优异（R² = 0.9989）、折射率分辨率为1.9 × 10^?6 RIU，在低于200美元的光源成本下提供竞争力性能，为已报道强度型SPRi系统中的最低者。作为概念验证生物应用，该生物传感器被应用于使用小分子抑制剂DC-LC3in-D5作为探针，对A549肺癌细胞裂解物中自噬相关LC3B积累进行无标记监测。SPRi响应显示出与流式细胞术和Western blotting完全一致的清晰剂量依赖性趋势，验证了该平台检测自噬活性的可靠性。凭借其无标记、无抗体和并行检测能力，所提出的系统在自噬调节药物候选物快速高通量筛选方面具有巨大前景。