金涂层外置半分布式干涉型光纤生物传感器用于CD44表达癌细胞的免标记检测

《Biosensors》：Gold-Coated Extrinsic Semi-Distributed Interferometric Fiber-Optic Biosensor for Label-Free Detection of CD44-Expressing Cancer Cells

　　

乳腺癌仍是女性癌症相关死亡的主要原因之一，其显著的分子异质性凸显了在细胞水平表征肿瘤细胞的必要性。CD44是一种与乳腺癌进展、转移及癌症干细胞样表型相关的跨膜糖蛋白，是选择性识别侵袭性基底样细胞群的有前景的生物标志物。然而，评估CD44表达的传统方法（包括免疫组织化学、免疫荧光和流式细胞术）需要标记和多步样品制备。本研究开发了一种金涂层的、基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的外置半分布式干涉（SDI）光纤生物传感器，其功能化修饰有抗CD44抗体，用于免标记、选择性检测表达CD44的HCC1806乳腺癌细胞。功能化传感器表现出浓度依赖性响应，检出限（LoD）为2.51 cells/mL；而无抗体的对照传感器暴露于HCC1806细胞、以及抗CD44功能化传感器暴露于CD44低表达的HEK293细胞时，仅表现出极小响应，支持在所测试条件下实现选择性检测。上述结果支持抗体功能化ESDI平台在免标记检测CD44表达细胞方面的潜力，为其在临床样品中的验证奠定了基础，是迈向肿瘤细胞诊断的一步。

研究背景方面，乳腺癌是全球女性中最常被诊断的癌症，也是癌症相关死亡的主要原因之一，其分子与表型异质性导致细胞群在增殖、侵袭、转移及治疗反应等方面存在差异，因而需要在细胞水平表征肿瘤细胞。细胞表面生物标志物适于该任务，其中CD44为一种跨膜糖蛋白，参与细胞黏附、迁移及与细胞外基质的相互作用，并与乳腺癌进展、转移及癌症干细胞样表型相关，尤其是CD44⁺/CD24^?/low表型与致瘤性基底样乳腺癌细胞群相关。目前存在的问题是，传统CD44表达评估主要依赖免疫组织化学、免疫荧光和流式细胞术，这些方法虽可提供细胞表征，但通常需要标记、多步样品制备和专用仪器。因此，开展免标记生物传感方法研究以克服上述局限具有必要性。研究人员开发了金涂层的、基于PDMS的外置半分布式干涉（ESDI）光纤生物传感器并功能化抗CD44抗体，实现了对表达CD44的HCC1806乳腺癌细胞的免标记、选择性检测，检出限（LoD）为2.51 cells/mL，对照实验显示选择性响应，表明该平台在免标记检测CD44表达细胞方面具有潜力，为临床样品验证及肿瘤细胞诊断奠定基础。

关键技术方法方面（不超过250字）：研究人员基于掺Mg硅酸盐纳米颗粒增强背散射光纤制备半分布式干涉（SDI）传感器，采用熔融 spliced 方式与单模光纤（SMF-28）连接形成Fabry–Pérot腔；经校准筛选灵敏度≥100 dB/RIU的传感器后，以PDMS涂覆形成外置结构（ESDI），经臭氧活化、APTMS硅烷化、磁控溅射沉积约30 nm金层，并以11-巯基十一烷酸（MUA）自组装单层及EDC/NHS化学共价固定抗CD44抗体，mPEG-胺封闭非特异位点；采用Micron Optics si255解调仪并结合光纤布拉格光栅（FBG）进行温度补偿检测；以原子力显微镜（AFM）和扫描电镜（SEM）表征表面；以COMSOL Multiphysics 6.2进行二维轴对称有限元仿真。细胞样品为ATCC来源的HCC1806与HEK293细胞系，未涉及临床队列来源。

研究结果方面，3.1 表面表征：通过AFM逐阶段表征传感器表面形貌，发现裸基底经piranha清洗后平均表面粗糙度（Ra）为0.9 nm，沉积PDMS后降至0.6 nm，沉积Au后显著增至4.1 nm，抗CD44功能化后增至44.7 nm；通过AFM台阶高度分析确定Au膜平均厚度为30.64 nm，SEM显示PDMS涂层呈椭圆形，平均直径为541 μm。3.2 CD44表达HCC1806细胞的检测与测定特异性：通过将抗CD44功能化传感器依次暴露于10至10⁶ cells/mL的HCC1806细胞悬液，发现在所选波长1565.22 nm处响应随浓度呈阶梯式增加，log线性校准拟合R² = 0.95，灵敏度为0.45 dB/decade，检出限（LoD）为2.51 cells/mL；通过对照实验（无抗体传感器暴露于HCC1806细胞、抗CD44传感器暴露于HEK293细胞）观察到响应分别仅为0.04–0.08 dB和0.04–0.14 dB，而抗CD44传感器对HCC1806细胞的响应为1.23–3.48 dB，支持选择性检测；SEM显示细胞黏附于传感器表面。3.3 金功能化对传感器性能的影响：通过比较Au涂层传感器与戊二醛（GA）涂层参考传感器对抗CD44功能化HCC1806细胞的响应，发现二者均呈浓度依赖性近线性响应，但Au沉积传感器R² = 0.95、LoD为2.51 cells/mL，而GA涂层传感器R² = 0.92、LoD显著更高为130.1 cells/mL，Au传感器绝对响应在六个浓度阶梯中稳步增加约2 dB，而GA传感器仅增加约1 dB。3.4 COMSOL仿真：通过对零、一、二个结合细胞及有无PDMS透镜情形进行光纤端面仿真，发现PDMS透镜存在时电场可进入透镜并到达结合细胞表面，无透镜时电场主要局限于纤芯内；有透镜时总反射率随细胞数由0.494增至0.526，响应由1个细胞的0.18 dB增至2个细胞的0.28 dB，而无透镜时响应保持在±0.03 dB内且无明确趋势，与Au涂层传感器实验结果一致，表明PDMS透镜在实现细胞检测中起重要作用。

讨论部分总结：金沉积PDMS基ESDI光纤生物传感器对表达CD44的HCC1806乳腺癌细胞表现出浓度依赖性光学响应；细胞悬液由计数原液十倍系列稀释制备，低浓度下细胞分布不均可能导致单份样品中细胞数变异，实验评估的最低浓度为10 cells/mL，估计LoD为2.51 cells/mL系基于校准的估计值，未在2.51 cells/mL直接测量。对照实验提供初步证据表明抗CD44介导的识别对观测响应有贡献，无抗体传感器响应接近基线提示非特异细胞–表面相互作用贡献较小，抗CD44传感器对CD44低表达HEK293细胞响应亦小；高细胞浓度下体折射率变化也可能有贡献，未来需量化该贡献并评估pH影响。金为稳定高亲和力基底，可能通过MUA/EDC-NHS化学促进硫醇介导的抗体固定，但改善的传感器响应不能直接证实抗体固定增强，需进一步表面表征；未来需采用XPS和FTIR研究不同功能化阶段的表面化学组成与官能团。COMSOL仿真考虑0、1、2个细胞，定性支持实验结果，表明PDMS透镜显著改善检测能力且响应随结合细胞数增长。尽管选用视觉上PDMS涂层均匀的传感器，涂层形貌的微小变化仍可能导致传感器间变异，需优化PDMS沉积工艺以提高重现性；此外所有结果均基于每种条件n = 1个传感器，误差棒代表30次连续读数的标准差，反映短期重复性而非器件间重现性，未来需采用多个独立制备的传感器评估重现性与制备成功率。研究结论部分翻译：据研究人员所知，本研究首次提出了金涂层、基于PDMS的外置半分布式干涉光纤生物传感器用于免标记检测表达CD44的乳腺癌细胞；抗CD44抗体功能化实现了对HCC1806的选择性、浓度依赖性检测，而无抗体和CD44低表达（HEK293）对照保持基线，在所测试条件下提供了选择性响应的初步证据；传感器在PBS中对10–10⁶ cells/mL呈log线性响应，LoD为2.51 cells/mL；未来工作应聚焦于临床或患者来源样品的验证，并将平台扩展至多重生物标志物检测以实现更全面的肿瘤细胞表征。