《Cells》：Investigating a Potential Link Between Metabolic-Neurotrophic Coupling in Breast Tumor Innervation in Bioengineered Models
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摘要专业翻译
代谢重编程是癌症的一个公认标志，其有助于侵袭、转移以及将组织驻留细胞招募至肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）等不良行为。在招募能力中，神经支配（innervation）已成为疾病进展的活跃贡献因素。尽管神经支配与
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代谢重编程是癌症的一个公认标志，其有助于侵袭、转移以及将组织驻留细胞招募至肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）等不良行为。在招募能力中，神经支配（innervation）已成为疾病进展的活跃贡献因素。尽管神经支配与患者不良预后相关，但在不同进展阶段调控神经招募的机制仍知之甚少。本研究探讨不同阶段的乳腺癌细胞如何与癌症的代谢联系及其促轴突生成能力相关联。研究人员使用了人同源MCF10乳腺上皮细胞系系列、三维胶原水凝胶、人脂肪基质细胞（adipose stromal cells, ASCs）以及新鲜分离的大鼠感觉神经元。多光子光学氧化还原成像（optical redox imaging）结合ATP生成速率测定验证了直接的代谢抑制，并突出了进展期细胞对谷氨酰胺的利用。研究人员分别鉴定了来自癌前和恶性培养物中脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor, BDNF）和胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF）的表达。有趣的是，当用代谢抑制剂处理时，MCF10细胞的单一培养降低了神经营养因子的释放，而与ASCs的共培养则表现出无变化甚至升高的神经营养因子分泌。综上所述，这些发现提出了乳腺肿瘤神经支配部分由阶段特异性代谢-神经营养耦合所塑造的可能性，为未来的研究提出了一个具体的机制性问题。
论文解读
一、研究背景与问题提出
癌症是美国第二大死亡原因，2026年预计死亡人数约60万。尽管癌症死亡率随新技术应用持续下降，全球每年新诊断的250万例乳腺癌使其成为全球发病率最高的癌症类型。环境、激素、生活方式和遗传风险因素均参与乳腺癌的发生，因此常规筛查和早期诊断十分必要。乳腺癌从正常上皮经癌前病变、导管原位癌（ductal carcinoma in situ, DCIS）、浸润性导管癌直至最终转移性肿瘤的进展过程，伴随着深刻的形态学和代谢重编程，塑造肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）并促进肿瘤生长。
癌症代谢最初主要与Warburg效应相关，即在有氧环境下肿瘤仍优先依赖糖酵解。目前学界已认识到更复杂的代谢功能，包括线粒体代谢动力学以及谷氨酰胺分解依赖（即谷氨酰胺成瘾）。通过糖酵解、三羧酸（tricarboxylic acid, TCA）循环和脂肪酸氧化，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）被还原为NADH，NADH随后参与氧化磷酸化（oxidative phosphorylation, OXPHOS）和ATP生成。侵袭性癌症被认为具有代谢可塑性，能在糖酵解与OXPHOS之间切换，从而在常氧、低氧、酸性环境及营养波动中增强生存能力，部分通过利用驻留基质细胞实现。
肿瘤微环境中一个快速涌现的新维度是癌症-神经相互通讯，其参与癌症发生和进展。肿瘤神经支配（即神经突侵入邻近肿瘤）已在多种癌症中被发现并促进肿瘤发展，导致患者疼痛增加和预后不良。来自肿瘤微环境的神经刺激信号，包括脑源性神经营养因子（BDNF）、胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）、神经生长因子（nerve growth factor, NGF）和神经营养因子3（neurotrophin 3, NT-3），可进一步增强乳腺肿瘤的神经支配。然而，代谢重编程在创造促轴突生成环境进而导致乳腺肿瘤神经支配方面的具体作用仍不清楚。尽管代谢重编程和癌症-神经串扰各自作为肿瘤微环境的特征已被认识，但二者之间的相互作用仍相对未被充分探索。
二、研究内容与主要发现
研究人员使用同源人乳腺上皮细胞系系列——MCF10A（10A，健康）、MCF10AneoT（AneoT，癌前病变）、MCF10DCIS.com（DCIS，早期癌症）和MCF10CA1a（CA1a，恶性）——表征了转录特征和代谢行为如何影响表型以建立神经支配性肿瘤微环境。这些细胞首先在模拟肿瘤微结构的3D胶原凝胶中培养，有或无脂肪基质细胞（ASCs）共培养，随后与背根神经节（dorsal root ganglia, DRG）感觉神经元共培养以测量神经突浸润。研究人员进一步靶向谷氨酰胺酶（GLS1）和乳酸脱氢酶A（LDHA），分别使用其药理学抑制剂BPTES和FX-11。
研究发现，AneoT培养物表现出OXPHOS和糖酵解的增强。健康细胞保持低代谢依赖性，DCIS细胞依赖糖酵解，而CA1a细胞表现出谷氨酰胺成瘾的迹象。值得注意的是，AneoT主要分泌BDNF，而CA1a主要释放GDNF。此外，AneoT培养物诱导更高程度的神经支配，表明肿瘤微环境的轴突生成启动可能在完全恶性发生之前的早期阶段就已出现。
三、关键技术与方法
研究人员使用了以下主要关键技术方法：基于人MCF10同源细胞系系列（10A、AneoT、DCIS、CA1a，来源包括ATCC和Karmanos癌症研究所）和人脂肪来源干细胞（ASCs，购自Lonza）构建三维胶原水凝胶培养体系；采用多光子光学氧化还原成像（multiphoton optical redox imaging）检测NADH和FAD自发荧光并计算光学氧化还原比值（optical redox ratio, ORR）；使用Seahorse ATP速率测定法直接测量糖酵解与OXPHOS的ATP生成偏好；进行批量RNA测序（bulk RNA-seq）和qRT-PCR验证转录特征；采用Luminex多重分析定量神经营养因子分泌；从3周龄Sprague Dawley大鼠（Envigo）分离背根神经节感觉神经元进行神经突生长分析。
四、研究结果
3.1 转录组学分析突出早期阶段特异性代谢调控。 通过3D培养后进行批量RNA测序，与正常10A培养物相比，AneoT细胞整体代谢调控升高，包括糖酵解、OXPHOS和TCA循环。DCIS和CA1a培养物中这些升高有所减弱，但与ASCs共培养时表现出升高的代谢基因特征。ASCs单一培养物高表达神经营养因子（BDNF、NGF、NTF3、GDNF）及其受体（NTRK2、GFRA1、GFRA2、GFRA3），并表达轴突导向基因（SLIT1、SLIT2、SEMA7A、UNC5B、ROBO2、CXCL12）。qPCR验证显示AneoT中BDNF和NTRK1表达升高，DCIS中NTRK2和GFRA1升高，CA1a中GDNF升高。
3.2 光学氧化还原成像揭示细胞阶段特异性对代谢抑制剂的响应。 随着细胞系恶性程度增加，ORR降低，表明更还原的环境。BPTES处理显著增加AneoT和CA1a培养物的ORR，而10A、DCIS和ASCs不受影响。FX-11处理显著降低AneoT、DCIS和CA1a的ORR，但对10A和ASC无影响。
3.3 Seahorse ATP速率测定显示细胞类型和抑制剂响应特异性的ATP生成偏好。 DCIS和CA1a表现出最高的总ATP生成速率。DCIS通过糖酵解生成的ATP贡献最高，而CA1a的线粒体ATP生成显著高于DCIS。BPTES处理抑制DCIS和CA1a的线粒体ATP合成，而FX-11对所有培养物影响甚微。
3.4 细胞外代谢物揭示BPTES和FX-11的阶段特异性抑制能力。 随着MCF10细胞进展，谷氨酰胺消耗和谷氨酸分泌增加。BPTES显著减少CA1a的谷氨酰胺消耗和谷氨酸分泌。FX-11显著减少DCIS的乳酸分泌。
3.5 神经营养因子转换与进展和代谢状态一致。 健康10A细胞神经营养因子分泌极低。AneoT细胞强释放BDNF。DCIS细胞分泌极低。CA1a细胞转向优先表达GDNF。ASCs单独培养时分泌最高总量的神经营养因子，但与MCF10细胞共培养时添加效应极小。FX-11处理显著降低AneoT的BDNF分泌。BPTES和FX-11联合治疗在CA1a单一培养中显著增加GDNF分泌，共培养中CA1a也增加GDNF释放。
3.6 早期AneoT在体外表现出优越的神经突生长能力。 所有培养物均诱导DRG神经突生长。BPTES和FX-11处理影响甚微，但CA1a+ASC共培养中BPTES显著减少神经突生长，DCIS+ASC共培养中FX-11增加神经突生长。在ASC共培养中，AneoT和CA1a的DRG神经突生长显著更高。条件培养基实验中，阻断BDNF（TrkB）和GDNF（GFRα1）受体后神经突生长无差异。
五、讨论与结论
研究人员发现，晚期乳腺癌细胞以谷氨酰胺为导向的代谢有助于氧化还原稳态、TCA回补和持续的氧化代谢能力。AneoT细胞表现出早期代谢基因的转录上调，DCIS细胞以糖酵解功能升高为特征，而CA1a在糖酵解升高的基础上获得谷氨酰胺分解灵活性。BPTES处理证实AneoT和CA1a依赖谷氨酰胺作为NADH来源和线粒体代谢的补充代谢物。FX-11介导的LDHA抑制导致NAD+再生受阻和NADH积累，而非直接影响ATP供应。
研究观察到MCF10细胞系列中不同的神经营养因子表达谱：AneoT细胞BDNF分泌升高，CA1a细胞GDNF释放显著增加。FX-11降低AneoT的BDNF，而联合治疗（BPTES+FX-11）在CA1a中升高GDNF。条件培养基单独作用对轴突生成贡献不显著，提示神经营养因子可能起支持性作用（如存活或维持），而神经突生长可能依赖直接的细胞间相互作用。
研究结论： 乳腺肿瘤神经支配是疾病恶化的一个快速涌现的贡献因素，但肿瘤微环境如何促进这一过程仍很大程度上未知。本研究显示，MCF10同源系列人乳腺上皮细胞表现出不同的代谢和轴突生成行为，基质细胞的存在可进一步增强这些行为。观察到阶段特异性的神经营养因子释放偏好，其与更长的DRG神经突生长相一致。综上所述，这些结果为机制研究提供了基础，并提出了几个可行的未来研究方向：基质细胞促进肿瘤神经支配的具体作用、不同神经营养因子景观如何驱动神经突浸润，以及代谢和神经营养扰动对乳腺肿瘤神经支配的联合作用。此外，探究核糖体活性可能有助于阐明观察到的转录与蛋白水平数据之间的差异。
