Sertoli细胞特异性敲除Hsp90aa1不显著损害雄性小鼠生育力

《Cells》：Sertoli Cell-Specific Deletion of Hsp90aa1 Does Not Overtly Impair Male Fertility in Mice

　　

应激诱导型分子伴侣HSP90α（由Hsp90aa1编码）在雄性生殖中发挥重要作用。系统性Hsp90aa1缺失可导致粗线期阻滞、生殖细胞丢失和无精子症。然而，系统性模型无法区分源于生殖细胞的效应与由睾丸体细胞微环境介导的效应。Sertoli细胞通过物理支持、营养供应和调控信号维持生殖细胞发育。HSP90α在Sertoli细胞中的功能此前主要在培养细胞中研究，缺乏体内证据。为探究其在Sertoli细胞中的作用，研究人员构建了Hsp90aa1^flox/flox；Amhr2-Cre⁺条件性敲除（CKO）小鼠。CKO小鼠睾丸Sertoli细胞富集组分中HSP90α显著降低，睾丸免疫荧光显示Sertoli细胞区域信号减弱。尽管存在该降低，CKO雄性仍保持生育力，且在睾丸形态、生精进程、所测精子参数、Sertoli细胞计数或连接相关蛋白定位方面均未见显著异常。然而，CKO睾丸中总生殖细胞计数轻度降低，降低主要见于精母细胞。这些发现表明，Sertoli细胞Hsp90aa1缺失与精母细胞数量轻度减少相关，但在所检测条件下并未明显损害雄性生育力。与系统性Hsp90aa1缺失的对比提示，HSP90α在雄性生殖中的需求具有细胞类型特异性。

研究背景方面，热休克蛋白90（HSP90）是高度保守的ATP依赖性分子伴侣，协助多种客户蛋白折叠成熟并维持蛋白稳态，同时调控信号转导、代谢与细胞应激反应。哺乳动物细胞含两种主要胞质HSP90亚型：应激诱导型HSP90α由Hsp90aa1编码，组成型HSP90β由Hsp90ab1编码。遗传学研究已确立HSP90α在雄性生殖中的必需作用：Hsp90aa1全身性破坏使精母细胞无法越过粗线期，导致成熟精子缺失和雄性不育；成年小鼠他莫昔芬诱导性Hsp90aa1缺失引起广泛生殖细胞丢失和生精阻滞；HSP90α还参与雄性生殖细胞piRNA生物合成和逆转录转座子抑制。然而，这些系统性模型在多组织和睾丸多种细胞群中破坏Hsp90aa1，无法确定所导致的不育是仅源于生殖细胞缺陷，还是也源于睾丸体细胞微环境紊乱。在可能参与系统性Hsp90aa1缺失所致不育的睾丸体细胞类型中，Sertoli细胞尤为相关，因其建立并维持生殖细胞发育的微环境，直接接触发育中的生殖细胞、提供营养与结构支持、传递旁分泌信号，并建立血睾屏障（BTB，由胞质接头蛋白ZO-1和跨膜紧密连接蛋白occludin等构成的动态连接复合体）；连接相关蛋白定位随生精上皮周期变化，Sertoli细胞连接破坏可损害生精。直接连接HSP90α与Sertoli细胞功能的证据仍有限：在培养的未成熟猪Sertoli细胞中，HSP90AA1过表达增加细胞活力、乳酸脱氢酶A活性和乳酸产生，而HSP90抑制剂17-AAG降低这些指标并促进凋亡；但来自未成熟猪细胞培养模型和药理抑制的证据无法确定完整睾丸内Sertoli细胞中内源性HSP90α是否具有生理需求，因此需要细胞特异性遗传模型在体内定义其功能。为此，研究人员通过Amhr2-Cre建立体内模型，在Sertoli细胞中删除Hsp90aa1，并检查出生后睾丸发育和雄性生育力，得出CKO雄性仍保持生育力、所检测生殖指标无主要异常、但生殖细胞计数轻度降低且主要见于精母细胞的结论；系统性Hsp90aa1缺失后缺乏严重表型提示HSP90α在不同睾丸细胞群中贡献不同。该研究的重要意义在于，其体内细胞特异性分析有助于将Sertoli细胞HSP90α的贡献与既往系统性Hsp90aa1缺失报道的严重生殖表型区分开来，并支持HSP90α对雄性生殖的贡献具有细胞类型依赖性。

关键技术方法方面（不超过250字）：研究人员采用Amhr2-Cre介导的Sertoli细胞特异性Hsp90aa1条件性敲除小鼠模型（Hsp90aa1^flox/flox；Amhr2-Cre⁺，C57BL/6遗传背景，对照为同窝Hsp90aa1^flox/flox；Amhr2-Cre^?），开展2个月生育力测试；利用公共单细胞RNA测序数据集GSE112393（经SMARTdb可视化）分析Hsp90aa1转录本；分离原代睾丸细胞富集组分（3周龄雄性，每份混合同基因型3只小鼠睾丸）并经SOX9/vimentin免疫荧光评估Sertoli细胞富集度；采用RT-qPCR、Western blotting、H&E与PAS染色、免疫荧光（含PNA顶体染色）、计算机辅助精子分析（CASA）及GraphPad Prism 11统计分析。

研究结果方面，3.1 HSP90α在小鼠Sertoli细胞中表达：通过公共单细胞RNA测序数据集可视化显示Sertoli细胞存在可检测的Hsp90aa1转录本，其中精母细胞相对转录水平最高，精原细胞和圆形精子细胞也较高，Sertoli细胞相对表达低于这些生殖细胞群；Western blotting在原代生殖细胞富集和Sertoli细胞富集组分中均检出HSP90α条带，平行培养的Sertoli细胞富集培养物中SOX9⁺和vimentin⁺细胞分别占DAPI⁺细胞的94.18%和92.33%；qPCR显示TM4细胞中Hsp90aa1 mRNA水平虽低于GC-2细胞但可检测（p = 0.0355），支持HSP90α在小鼠Sertoli细胞中表达并为研究其在司该细胞群中的作用提供依据。3.2 Sertoli细胞特异性Hsp90aa1条件性敲除小鼠的构建与验证：通过Amhr2-Cre构建条件性敲除小鼠，靶向Hsp90aa1-flox等位基因以loxP位点侧翼包围外显子9和10，经Cre介导重组删除；PCR基因分型确认CKO小鼠为Hsp90aa1-flox纯合且Amhr2-Cre转基因阳性；Western blotting显示CKO小鼠原代Sertoli细胞富集组分中HSP90α蛋白较对照显著降低；睾丸切片免疫荧光显示对照中HSP90α见于SOX9⁺Sertoli细胞核周围胞质并与vimentin⁺区域重叠，而CKO中核周HSP90α信号显著降低且与vimentin重叠不再可检测，支持CKO小鼠Sertoli细胞中HSP90α成功耗竭。3.3 Sertoli细胞特异性Hsp90aa1缺失保持雄性生育力、相对睾丸重量或精子参数：成年CKO雄性外观及睾丸附睾大体形态与对照相似；2个月生育力试验中所有CKO雄性均产生后代，平均每窝幼仔数无显著差异；相对睾丸重量（睾丸/体重比）组间相当；CASA显示总精子活力和附睾尾精子浓度无显著差异，附睾尾精子明场外观相似，表明CKO雄性在所检测指标下保持生育力。3.4 CKO小鼠睾丸结构和生精进程基本保留：比较P1、P9、P17和P35的H&E染色切片，各年龄两组生精索或曲细精管组织及发育生殖细胞的预期年龄相关外观大致相似；成年睾丸两组均显示组织化曲细精管含各发育阶段生殖细胞，附睾尾腔可见精子；平均曲细精管直径和上皮厚度组间无显著差异；PAS染色显示两组均鉴定出所检测阶段的曲细精管，各阶段组比例无显著差异；PNA染色显示两组在所示精子形成步骤中顶体形态预期变化，表明CKO小鼠睾丸结构或所评估生精进程无重大破坏。3.5 Sertoli细胞特异性Hsp90aa1缺失轻度降低生殖细胞计数而不影响Sertoli细胞计数：SOX9⁺Sertoli细胞核保持预期基底位置，每个曲细精管横截面平均计数组间无显著差异；而CKO睾丸每个曲细精管横截面DDX4⁺生殖细胞平均数量轻度降低（p = 0.0277）；LIN28⁺和c-KIT⁺精原细胞计数组间无显著差异；SYCP3⁺细胞平均计数在CKO睾丸轻度降低（p = 0.0366）；在VII期曲细精管中，CKO小鼠粗线期精母细胞计数较低（p = 0.0156），而圆形和长形精子细胞计数组间无显著差异，表明总生殖细胞计数轻度降低主要与精母细胞群相关，而未检测到所检查精原细胞或精子细胞群降低。3.6 CKO睾丸中ZO-1和occludin基础定位保留：免疫荧光显示ZO-1在对照组和CKO组均集中于生精上皮基底部附近，两组沿基底室形成可比较的连续模式，放大图像确认CKO睾丸中ZO-1整体定位和分布维持；occludin在对照组和CKO曲细精管中显示相似的基底分布，表明Sertoli细胞特异性Hsp90aa1缺失后ZO-1和occludin的观察定位模式保留。

讨论部分总结：本研究利用Amhr2-Cre介导的条件性Hsp90aa1敲除模型检查Sertoli细胞HSP90α对雄性生殖的贡献，HSP90α在Sertoli细胞富集组分中显著降低且睾丸染色显示标记识别的Sertoli细胞区域信号减弱；在所检测条件下CKO雄性保持生育力，所测精子参数、出生后睾丸结构或生精上皮阶段分布均未检测到重大变化；该体内细胞特异性分析有助于区分Sertoli细胞HSP90α的贡献与既往系统性Hsp90aa1缺失报道的严重生殖表型。Sertoli细胞CKO模型较轻的表型提示仅该区域HSP90α丢失不能重现那些严重缺陷，同时精母细胞计数降低表明Sertoli细胞HSP90α可能有助于支持该生殖细胞群的环境，但本研究未确定该降低的直接原因；整体SYCP3⁺计数与VII期粗线期精母细胞计数一致增强了精母细胞参与DDX4⁺细胞轻度降低的解释，阶段匹配计数也减少上皮阶段分布差异的影响；VII期分析中圆形和长形精子细胞计数均无显著差异，所测精子参数和生育力保持，提示八周时观察到的细胞变化未伴随所测下游生殖结局的可检测下降。对精母细胞轻度降低的一种可能解释是Sertoli细胞代谢支持改变：培养的未成熟猪Sertoli细胞研究将HSP90AA1与乳酸产生联系起来，而Sertoli细胞来源乳酸作为发育中生殖细胞（包括精母细胞和精子细胞）的能量底物，乳酸支持减少可能促成CKO小鼠较低的精母细胞计数；由于本研究未测乳酸产生，该可能性仍待检验，物种、发育阶段和实验设置差异也可能解释培养细胞报道的显著效应为何未在模型中反映为重大生育力表型。CKO睾丸中ZO-1和occludin保留观察到的基底定位模式，支持所检查两种蛋白定位的保持，但不能确立BTB通透性正常，需功能性示踪剂试验直接检测屏障通透性；尽管组织染色和Sertoli细胞富集组分Western blotting支持Sertoli细胞中HSP90α显著降低，但未直接确定Sertoli细胞中Amhr2-Cre介导重组的程度，因此不能确立每个Sertoli细胞均被靶向；出生后组织学和成年Sertoli细胞计数未显示明显发育缺陷，但未直接检查胚胎期Sertoli细胞增殖和存活，不能排除早期或短暂效应；标准饲养条件下无重大异常也不排除应激时对HSP90α更大需求，鉴于HSP90α为应激响应型，未来工作可评估Sertoli细胞Hsp90aa1缺失在特定挑战下是否改变生殖细胞支持或连接组织。研究结论部分翻译：使用Amhr2-Cre介导的条件性敲除模型，研究人员发现Sertoli细胞特异性Hsp90aa1缺失与精母细胞计数轻度降低相关；尽管如此，CKO雄性在所检测条件下保持生育力，所测精子参数、睾丸组织学或生精上皮阶段分布无重大异常，ZO-1和occludin的基础定位也保留。这些发现表明，在标准实验室条件下Sertoli细胞Hsp90aa1缺失不明显损害雄性生育力，尽管其与精母细胞群的细微变化相关。