《Cells》：The Effects of Rho-Associated Kinase (ROCK) Inhibitor Supplementation in Corneal Preservation Media for Donor Tissue Used in Descemet’s Membrane Endothelial Keratoplasty (DMEK)
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摘要
目的：本研究旨在评估在Descemet膜内皮角膜移植术（DMEK）移植片制备及采用内皮朝内（endothelium-in）与内皮朝外（endothelium-out）两种植入技术操作过程中，使用Rho相关激酶抑制剂（ROCKi）Netarsudil（AR
摘要
目的：本研究旨在评估在Descemet膜内皮角膜移植术（DMEK）移植片制备及采用内皮朝内（endothelium-in）与内皮朝外（endothelium-out）两种植入技术操作过程中，使用Rho相关激酶抑制剂（ROCKi）Netarsudil（AR-13324）预处理供体角膜组织对角膜内皮细胞（CECs）活力的影响。方法：本离体对比研究共使用24对研究级人供体角膜，保存于Optisol-GS保存液中。每对角膜中，一眼在含1 μM AR-13324的保存液中孵育2小时，对侧眼作为对照。DMEK组织制备后，分别采用内皮朝内（Endoglide）或内皮朝外（Geuder玻璃注射器）技术进行模拟植入。执行组织制备与植入操作的外科医生对ROCKi处理分组设盲。操作完成后，采用Calcein-AM和Ethidium homodimer-1染色进行活/死细胞毒性检测。通过荧光显微镜及ImageJ（版本1.54p）分析定量活细胞、脱落细胞及死亡细胞的百分比。同时分析供体年龄、保存时间与细胞活力之间的相关性。结果：在内皮朝外模型中，对照组活细胞百分比显著低于ROCKi处理组（89.6 ± 5.35% vs. 95.1 ± 3.74%，p = 0.0001），而对照组死亡细胞百分比显著更高（7.13 ± 3.71% vs. 2.16 ± 1.39%，p = 0.0017）。在内皮朝内模型中，对照组活细胞百分比显著低于ROCKi处理组（86.8 ± 4.81% vs. 94.4 ± 3.26%，p = 0.0001），且对照组脱落细胞百分比（8.21 ± 5.02% vs. 4.05 ± 2.82%；p = 0.0036）和死亡细胞百分比（5.04 ± 3.52% vs. 1.56 ± 1.13%；p = 0.0070）均显著更高。未发现供体年龄或保存时间与细胞活力结果之间存在显著相关性。对比分析显示，在ROCKi处理条件下，两种DMEK技术之间的细胞存活率无显著差异。结论：无论采用何种移植片植入技术，使用ROCKi AR-13324进行预孵育均可显著提高DMEK移植片制备和操作过程中角膜内皮细胞的活力并减少细胞死亡。将ROCKi处理纳入组织制备方案可能增强内皮保存效果，有望拓展其在眼库中的临床应用价值并提高角膜移植物的存活率。
论文解读
一、研究背景与问题
角膜透明性和完整性是维持正常视觉功能的基础。角膜内皮细胞（corneal endothelial cells，CECs）通过主动液体调节维持角膜透明度，但人类CECs在体内再生能力极为有限，一旦因原发性内皮疾病或继发性内皮病变受损，将导致不可逆的功能丧失。在Fuchs角膜内皮营养不良（Fuchs endothelial corneal dystrophy，FECD）和人工晶体眼大疱性角膜病变（pseudophakic bullous keratopathy，PBK）等疾病中，CECs持续丢失，邻近细胞虽发生形态学改变以代偿维持组织功能，但这进一步增加了剩余细胞的能量需求，导致线粒体耗竭、氧化应激乃至细胞凋亡。当CECs密度下降至临界阈值以下时，剩余细胞无法维持角膜基质液体稳态，最终导致角膜失代偿、透明度丧失和视力损害。FECD和PBK是全球角膜移植的主要适应证。
过去二十年间，内皮角膜移植术（endothelial keratoplasty，EK），包括Descemet膜内皮角膜移植术（DMEK）和Descemet膜剥离自动内皮角膜移植术（DSAEK），已逐步取代穿透性角膜移植术（penetrating keratoplasty，PK），成为角膜内皮疾病的主要手术干预方式，因其视觉恢复更快、手术散光更小、排斥率更低。DMEK相比DSAEK在最佳矫正视力、恢复速度和排斥率方面均表现更优。然而，移植后早期内皮细胞丢失（endothelial cell loss，ECL）显著，术后前六个月丢失率可达29%至48%，此后转为每年约9%的缓慢稳定下降。术后6个月较低的内皮细胞密度（endothelial cell density，ECD）与各术式移植失败风险升高相关，因此最大限度减少围手术期细胞丢失对提高移植物长期存活至关重要。
DMEK虽临床效果良好，但较DSAEK存在更多技术挑战，包括更陡峭的学习曲线，尤其在移植片制备、植入和眼内展开环节。移植片操作可导致更大的细胞丢失，甚至早期移植失败。为改善移植物存活，当前证据强调术前严格评估移植物质量和术中精细操作以减少内皮损伤。为降低手术学习难度并提高手术结果的可预测性和一致性，眼库已开始制备预剥离和预装载的DMEK组织。
在全球供体角膜短缺的背景下，最大限度提高供体组织存活率至关重要。Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶（Rho-associated coiled-coil protein kinases，ROCKs）是调节细胞黏附、运动、增殖、分化和凋亡等多种基本细胞过程的丝氨酸/苏氨酸激酶。最新证据支持ROCK抑制可刺激体内CECs增殖、细胞迁移并具有一定凋亡抑制作用。研究人员前期已证明ROCK抑制剂（ROCK inhibitors，ROCKis）Y-27632可显著改善CECs的贴附和增殖并增强细胞迁移。进一步研究发现Netarsudil（AR-13324）对原代人CECs的作用与Y-27632相当甚至更优。目前ROCKis已获批用于青光眼治疗，并正在探索其在角膜内皮疾病中的潜在作用。研究人员假设ROCKis可能在DMEK过程中增强角膜内皮保存效果，为此开展了本研究。
二、研究设计与方法
本研究为实验性离体（ex vivo）研究，采用配对供体眼设计。共获取24对研究级人尸体角膜（来自美国坦帕Lions眼移植研究所，均获得近亲书面同意并遵循赫尔辛基宣言原则），保存于Optisol-GS中，4°C条件下于保存后21天内处理。每对中一眼在含1 μM AR-13324的保存液中孵育，对侧眼作为对照。研究采用的主要关键技术方法包括：SCUBA技术进行Descemet膜（DM）剥离；两种DMEK移植片装载和植入模拟模型——内皮朝外模型（Geuder玻璃注射器）和内皮朝内模型（DMEK EndoGlide?），所有剥离、装载和拉出操作均由一名经验丰富的外科医生执行且对实验分组设盲；活/死细胞毒性检测（Calcein-AM和Ethidium homodimer-1染色）结合荧光显微镜成像和ImageJ（版本1.54p）图像分析，定量活细胞、脱落细胞和死亡细胞百分比；配对Student's t检验和Pearson相关性检验进行统计分析。研究还进行了48小时ROCKi孵育优化实验（4对）以评估长时间孵育的安全性。
三、研究结果
3.1 供体信息
研究使用24对研究级人角膜巩膜组织，供体年龄43至67岁，ECD介于1232至3597 cells/mm2之间，保存时间为8至21天。配对分析显示每例供体右眼（OD）和左眼（OS）基线ECD无显著差异。多变量分析显示供体年龄、性别和保存时间与活细胞、脱落细胞和死亡细胞百分比之间无显著相关性。
3.2 48小时ROCKi孵育优化实验
经48小时1 μM AR-13324孵育后，采用内皮朝内拉出技术，处理组与对照组在活细胞、死亡细胞和脱落细胞百分比上均无显著差异，表明长达48小时的ROCKi孵育对细胞无损害。为使方案在临床环境中可行，后续实验将孵育时间缩短为2小时。
3.3 2小时ROCKi孵育对DMEK组织的影响
3.3.1 内皮朝外技术（Geuder玻璃注射器）
该模型使用10对匹配供体角膜，供体平均年龄58.9 ± 7.8岁，保存至处理时间8至14天。活/死染色定量分析显示，AR-13324处理组活细胞百分比显著高于对照组（95.1 ± 3.74% vs. 89.6 ± 5.35%，p = 0.0001），死亡细胞百分比显著低于对照组（2.16 ± 1.39% vs. 7.13 ± 3.71%，p = 0.0017）。脱落细胞百分比两组间无显著差异（2.70 ± 3.52% vs. 3.27 ± 3.02%）。相关性分析显示供体年龄和保存时间与细胞活力参数之间均无显著相关。
3.3.2 内皮朝内技术（DMEK Endoglide）
该模型使用10对匹配供体角膜，供体平均年龄56.0 ± 8.3岁，保存至处理时间10至21天。AR-13324处理组活细胞百分比显著高于对照组（94.4 ± 3.26% vs. 86.8 ± 4.81%，p = 0.0001），脱落细胞百分比（4.05 ± 2.82% vs. 8.21 ± 5.02%，p = 0.0036）和死亡细胞百分比（1.56 ± 1.13% vs. 5.04 ± 3.52%，p = 0.0070）均显著降低。相关性分析显示年龄和保存时间与各结果指标之间均无显著线性关系。两种技术间的对比分析显示，在ROCKi处理条件下，内皮朝内与内皮朝外技术之间的细胞存活率无显著差异。
四、讨论与结论总结
讨论部分指出，ROCK抑制的保护效应机制可能涉及ROCK在细胞骨架组织和应激诱导凋亡放大中的作用。通过抑制ROCK，AR-13324可能在组织操作和植入这一内皮细胞承受显著应激的时期帮助维持内皮细胞结构并减弱凋亡信号。既往研究已证实ROCKis可增强CECs黏附、迁移和增殖能力。Okumura等证明注射补充Y-27632的培养CECs可改善内皮功能障碍动物模型中的细胞黏附，ZO-1和Na?/K?-ATPase表达增加提示功能恢复；Y-27632的局部或前房内给药可加速角膜内皮创面愈合。研究人员前期研究也表明Y-27632预处理培养的原代CECs在解离扩增时呈现促生存趋势。在FECD患者中，ripasudil 0.4%作为Descemet剥离术后辅助治疗可改善内皮细胞恢复、视力和角膜透明度；Price等报道Netarsudil 0.02%滴眼液可显著降低有症状FECD患者的中央角膜厚度并改善最佳矫正视力。
本研究发现，在未处理对照组中，内皮朝内技术的细胞脱落率显著高于内皮朝外技术（p = 0.015），而ROCKi处理后两种技术之间无显著差异，提示ROCKi可增强内皮细胞对制备和植入过程中机械应激的抵抗力。ROCKi处理对供体内皮组织的细胞保护效应对眼库和角膜移植具有重要实践意义：预孵育ROCKi可减少移植片制备、运输或术中操作过程中的细胞丢失，尤其对预剥离或预装载DMEK组织；该方案可轻松整合入临床流程而不显著影响手术后勤；通过最大化现有移植物的存活率，有助于缓解全球供体角膜短缺。48小时孵育无不良效应也支持在补充ROCKi的保存液中进行海外组织运输的可行性。研究局限性包括：离体环境无法完全模拟前房的生理代谢环境；配对设计虽减少供体变异但样本量仍需扩大；2小时暴露方案虽保证临床可行性但未完全反映长期效应；开放容器操作和温度变化可能影响内皮代谢和活力；1 μM浓度选择基于现有文献但尚无离体应用最佳浓度共识；研究级角膜ECD范围较宽可能限制对符合临床标准供体角膜的直接推广性；未评估AR-13324对内皮细胞功能和移植物结局的长期影响。
研究结论：本研究证明，供体角膜组织的短期ROCKi预处理可在模拟DMEK组织制备、装载和植入过程中显著提高内皮细胞存活率，且不受装载构型影响。AR-13324的细胞保护效应凸显其作为眼库和内皮移植方案中临床可行辅助手段的潜力，为未来将离体结果与体内移植物存活和术后内皮功能相关联的研究奠定了基础。需进一步研究将这些发现转化为临床实践，并可能有助于应对全球供体角膜短缺问题。
