《Cell》：Multimodal spatial transcriptomics redefines cortical pathology in Huntington’s disease
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亨廷顿病（Huntington’s disease, HD）由亨廷顿蛋白基因（HTT）中CAG重复序列扩增所致，但体细胞重复不稳定性与HTT包涵体如何关联于人脑组织选择性细胞丢失仍不清楚。研究人员开发了一种多模态空间转录组学策略，可在完整脑切片每个细胞中以亚细
亨廷顿病（Huntington’s disease, HD）由亨廷顿蛋白基因（HTT）中CAG重复序列扩增所致，但体细胞重复不稳定性与HTT包涵体如何关联于人脑组织选择性细胞丢失仍不清楚。研究人员开发了一种多模态空间转录组学策略，可在完整脑切片每个细胞中以亚细胞分辨率定义转录程序、测定体细胞CAG重复长度，并检测包括HTT包涵体在内的9种病理标志物。通过对对照组与HD皮层428173个细胞成像，研究发现第5–6层近投射（L5–6 NP）神经元与第6b层深层层 excitatory 神经元选择性易损，丢失超过50%，并与大片段体细胞CAG扩增（>450±55 CAGs）密切相关；核内HTT包涵体在中等长度扩增（250–350 CAGs）中最普遍，且比单纯重复扩增关联更广的转录改变。该数据既提供全面资源，也建立连接重复扩增与蛋白病理的通用框架。
研究背景与立项依据
亨廷顿病（Huntington’s disease, HD）是一种由HTT基因1号外显子CAG重复扩增驱动的神经退行性疾病，扩增产物形成异常多聚谷氨酰胺（polyQ）并促发突变HTT错误折叠与聚集。既有研究提示，基因组CAG长度是发病年龄的最强预测因子，而DNA错配修复相关修饰基因进一步调控体细胞重复不稳定性（somatic repeat instability）。然而，两个核心病理过程——HTT蛋白聚集形成包涵体，以及体细胞CAG持续扩增——如何在完整人脑中以单细胞精度共同决定细胞类型选择性丢失，长期缺乏原位、多模态、空间保留的定量证据。传统单核RNA测序（snRNA-seq）虽可联合长读长测序评估重复长度，但丢失空间架构与蛋白定位信息；常规空间转录组则难以同时读取重复长度、蛋白包涵体与转录状态。因此，研究人员在《Cell》发表本研究，旨在建立一种可在原位整合上述维度的技术框架，并重新定义HD皮层病理。
主要技术方法
研究人员构建多模态MERFISH（Multimodal multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization）平台：将编码探针经丙烯酸酯修饰锚定至组织内聚丙烯酰胺凝胶，实现长周期成像稳定性；组合编码探针配合顺序smFISH解码1128个基因转录本，并保留空间与亚细胞形态。平台进一步整合免疫荧光，检测HTT及8个附加蛋白标志物（含γH2AX、H3K9me3、H3K27ac等）；另设CAG重复探针与分支扩增，以HTT外显子探针归一化亮度估算单细胞体细胞CAG长度，并以已知CAG等位基因的人胚胎干细胞与HttQ175小鼠组织校准。样本来自荷兰脑库与华盛顿大学脑库的人死后额叶皮层，含5例HD与4例非神经疾病对照，后续扩展至6对照与8 HD样本，依细胞类型标记与空间柱面计量进行立体学式定量。
研究结果
多模态空间转录组学
研究人员通过多模态MERFISH在完整皮层切片中实现细胞分割与Leiden聚类，定义28类细胞簇，其分子特征与公共snRNA-seq高度一致。该平台可同步获得每细胞的1128基因转录谱、HTT RNA中CAG估算长度、HTT蛋白及核内/核外包涵体定位，验证信号保留率达94.7%。结论：该技术可在空间背景下以单细胞精度整合转录、重复扩增与蛋白病理。
HD额叶皮层的细胞谱系分析
通过等宽皮层柱立体学计数发现，兴奋性神经元总体轻度减少，但亚型差异显著：L5–6 NP神经元丢失约84%，L6b神经元丢失约53%；抑制性神经元中chandelier与SST阳性细胞各减少约50%。HTT转录丰度与易损性无显著相关。结论：HD皮层退化高度亚型特异，深层投射神经元与特定中间神经元最脆弱。
HTT核内包涵体未富集于丢失最严重细胞类型
免疫标记显示包涵体分核内与核外两类，核外更亮、更大且多见于深层。核内包涵体主要位于兴奋性神经元，但在丢失最严重的L5–6 NP中反而未检出，而在相对耐受的L3 IT中比例最高。结论：核内包涵体不是细胞丢失的直接等价指标，其分布与易损性解耦。
大片段体细胞CAG扩增与兴奋性神经元丢失相关
smFISH-CAG估算显示，对照组无大扩增，HD中L5–6 NP与L6b出现>450±55 CAG的极端扩增，其比例与兴奋性神经元丢失正相关；MSH3等经典扩增基因未显示皮层预测力。结论：极端体细胞CAG扩增是深层兴奋性神经元选择性退变的关键分子事件。
核内包涵体在中等长度扩增区间最普遍
单细胞共分析表明，核内包涵体随CAG增长而增多，但在250–350±55 CAG区间达峰值，更长扩增时反而下降。结论：包涵体形成存在重复长度依赖的“倒U型”关系，非单纯剂量线性过程。
DNA损伤与染色质沉默伴随扩增与包涵体
γH2AX与抑制性标记H3K9me3在含核内包涵体及中等扩增细胞中升高，活跃染色质标记H3K27ac不变，脂褐素随扩增累积。结论：重复扩增与核内聚集协同带来DNA双链断裂、异染色质化及老化代谢负担。
转录失调更紧密关联核内HTT包涵体而非重复扩增本身
配对近邻分析显示，单纯大扩增引起 modest 转录改变；核内包涵体细胞则放大CBX8、HAND2、HSPA1A/B、NXF1等应激与核质运输相关基因改变。结论：核内HTT聚集比重复长度本身更能驱动广泛转录重编程。
讨论与结论翻译
讨论指出，多模态MERFISH弥补了既往测序法无法在原位同时读取细胞类型、包涵体大小、CAG扩增与空间背景的缺口。大型体细胞扩增与L5–6 NP、L6b神经元丢失相连，但机制非MSH3单一主导；核内包涵体在中等CAG区间最频现，并放大转录紊乱。抑制性神经元丢失则不能仅用细胞自主扩增解释，提示非细胞自主机制参与。该框架可拓展至其他重复扩增疾病（如SCA、FXTAS、Friedreich共济失调、ALS/FTD中C9ORF72重复）。
研究结论如下：研究人员建立了在完整人脑组织中同时测量重复不稳定性、蛋白包涵体与转录状态的多模态空间转录组学框架；发现HD皮层选择性易损由深层兴奋性神经元的大片段体细胞CAG扩增主导，而核内HTT包涵体在中等扩增水平最显著且与更广转录失调相关；选择性神经退化源于重复扩增、蛋白聚集与细胞身份的交互作用，而非单一病理轴线。
