《Cells》：Integrated Transcriptomic and Functional Analyses Identify an FSH-Regulated circARHGAP21/gga-miR-146a-5p/DEAF1 Module in Chicken Granulosa Cells
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卵泡刺激素（FSH）支持卵泡发育过程中的颗粒细胞存活，但相关RNA网络尚未被完全阐明。为探究上述网络，研究人员在体外培养的鸡前等级卵泡颗粒细胞中整合了全转录组分析与功能实验。转录组比较包括对照组、FSH组及FSH联合核输出抑制剂leptomycin B（LMB
卵泡刺激素（FSH）支持卵泡发育过程中的颗粒细胞存活，但相关RNA网络尚未被完全阐明。为探究上述网络，研究人员在体外培养的鸡前等级卵泡颗粒细胞中整合了全转录组分析与功能实验。转录组比较包括对照组、FSH组及FSH联合核输出抑制剂leptomycin B（LMB）组。对上述表达谱的整合分析鉴定出一个候选的circARHGAP21/gga-miR-146a-5p/DEAF1调控模块。FSH增加circARHGAP21与DEAF1表达并降低gga-miR-146a-5p丰度，而LMB在FSH处理细胞中逆转上述变化。报告基因实验显示，gga-miR-146a-5p通过circARHGAP21及DEAF1 3′非翻译区中的预测位点抑制报告基因活性。转染oe-circARHGAP21构建体降低凋亡并增加卵泡刺激素受体（FSHR）表达。构建体转染还增加增殖细胞核抗原（PCNA）表达并降低caspase-3（CASP3）表达。共转染gga-miR-146a-5p mimic可减弱上述效应，而DEAF1过表达产生的变化与oe-circARHGAP21构建体转染后观察到的变化相似。与oe-circARHGAP21构建体组相比，相应的LMB处理组显示较低的DEAF1、FSHR与PCNA表达以及较高的CASP3表达与凋亡。综上，上述发现鉴定出一个FSH应答性circARHGAP21/gga-miR-146a-5p/DEAF1模块，该模块与颗粒细胞存活及卵泡选择相关基因表达有关。
研究背景方面，卵泡选择决定母鸡前等级卵泡能否进入排卵前等级，从而维持排卵与产蛋。在此转变过程中，颗粒细胞（GCs）获得FSH应答性并协调存活、增殖与分化。FSH与卵泡刺激素受体（FSHR）结合激活cAMP/PKA与PI3K/AKT信号，诱导受体表达与类固醇生成程序并抑制凋亡。FSHR表达随母鸡GCs获得选择相关FSH应答性而升高，使其成为卵泡选择的分子标志；增殖细胞核抗原（PCNA）是DNA复制相关的增殖活性标志，caspase-3（CASP3）是凋亡的核心执行者。然而，FSH信号如何与亚细胞运输及转录后调控协同以稳定选择相关GC状态仍知之甚少。核质运输在细胞外信号与基因表达之间提供调控界面，核孔复合体选择性控制蛋白质与核糖核蛋白复合体在核质间的双向运输。染色体区域维持蛋白1（CRM1，又称exportin 1或XPO1）以RanGTP依赖方式识别富含亮氨酸的核输出信号，经典CRM1抑制剂leptomycin B（LMB）通过共价修饰CRM1阻断货物结合，广泛用于干扰核输出。在鸡GCs中，FSH激活的AKT促进FOXO1磷酸化与核排斥，FOXO1亦参与哺乳动物模型中的GC凋亡与细胞周期抑制；研究人员此前将FSH诱导的FOXO1核排斥与鸡GCs中FSHR表达、增殖与存活相联系，提示核运输参与卵泡选择，但其对FSH应答性RNA网络的影响尚不清楚。FSH应答性基因表达变化不限于mRNA，还延伸至其他RNA类别：microRNA调控靶mRNA稳定性与翻译；circRNA经反向剪接产生，可影响RNA稳定性、转录、翻译及RNA结合蛋白互作。在鸡卵巢GCs中，circRNA表达随卵泡发育而变化；卵巢miRNA调控转录后基因表达、GC凋亡、卵泡发育与类固醇生成；miR-146a-5p在其他细胞类型中参与多种调控程序，在鸡GCs中可减弱AKT信号、增殖、脂质沉积与孕酮生物合成。部分反向剪接circRNA可参与circRNA–miRNA调控，但机制解释需要共定位、化学计量与内源靶标去阻遏证据。目前尚不清楚鸡GCs中哪些非编码RNA响应FSH、这些响应如何被核输出扰动改变，以及由此产生的候选模块是否与凋亡相关。为此，研究人员比较了6–8 mm鸡前等级卵泡培养GCs中mRNA、miRNA与circRNA表达谱，细胞分为对照、FSH及FSH联合LMB条件，LMB作为药理学筛选工具以优先筛选含潜在核质穿梭功能蛋白的FSH调控RNA网络；结合差异表达分析、九象限筛选与靶标预测选出候选模块，并用qRT-PCR、RNase R消化、定位与报告基因实验、过表达及miRNA mimic共转染评估分子特征及其与FSHR、PCNA、CASP3和凋亡的关联。研究得出，FSH应答性circARHGAP21/gga-miR-146a-5p/DEAF1模块与GC存活及卵泡选择相关基因表达相关，转染oe-circARHGAP21构建体增加FSHR与PCNA表达并降低凋亡，mimic共转染与DEAF1过表达提供互补支持，LMB比较描述了所测试处理背景下的药物相关表达与表型变化。其意义在于将FSH应答性RNA表达与GC存活及卵泡选择相关分子反应相联系，为前等级卵泡中该关系的功能研究提供框架。
关键技术方法方面，研究以80只21周龄Lohmann Brown蛋鸡为来源群，其中21只作为组织供体（9只专用于测序，每组3只；12只提供非测序实验材料），采集每只约10个6–8 mm前等级卵泡分离培养GCs，设对照、10 ng/mL FSH及FSH联合10 ng/mL LMB三组处理12 h，每组三个生物学重复。采用链特异性全转录组长RNA与小RNA文库构建及Illumina HiSeq 4000与NovaSeq 6000测序，结合fastp、Bowtie2、HISAT2、CIRIquant、edgeR、DESeq2、StringTie、miRDeep2等生物信息学流程进行差异表达、九象限筛选与ceRNA网络构建；并以qRT-PCR、RNase R消化、RNA荧光原位杂交（RNA-FISH）、免疫荧光（IF）、核质RNA分离、双荧光素酶报告基因实验、Western blotting与Annexin V-FITC/PI流式细胞术进行验证。
研究结果方面，3.1 FSH诱导的GCs转录组变化可被LMB改变：通过全转录组测序比较对照（C）、FSH（F）与FSH联合LMB（L）组，主成分分析区分三组而组内重复聚集，F-versus-C鉴定466个差异表达基因（DEGs，174上调、292下调），L-versus-F鉴定1140个DEGs（645上调、495下调），L-versus-C鉴定800个DEGs（348上调、452下调），并鉴定各比较中miRNA与circRNA候选；GO分类与KEGG富集（L-versus-F中黏着斑、ECM–受体互作与肌动蛋白骨架调控经多重检验校正后仍显著）表明FSH引发协同转录组变化而LMB广泛改变FSH应答表达谱。3.2 整合网络分析鉴定候选circARHGAP21/gga-miR-146a-5p/DEAF1模块：通过九象限分析整合F-versus-C与L-versus-F比较筛选对FSH与LMB呈相反响应的分子，构建候选circRNA–miRNA–mRNA网络，DEAF1与gga-miR-146a-5p形成预测miRNA–mRNA对，novel_circ_010489含预测gga-miR-146a-5p位点并因源于ARHGAP21位点命名为circARHGAP21；因DEAF1为具实验表征核定位与核输出信号的转录因子而优先选为候选穿梭蛋白；qRT-PCR证实测序所观察表达变化方向，支持该模块优先用于分子表征与功能获得分析。3.3 circARHGAP21注释、相对RNase R抗性及候选模块亚细胞分布：转录本注释将circARHGAP21（novel_circ_010489；2112 nt）归于涉及ARHGAP21外显子5–8的预测反向剪接事件，RNase R处理显著降低线性ARHGAP21丰度；RNA-FISH显示circARHGAP21主要位于胞质、gga-miR-146a-5p呈核质信号，DEAF1免疫荧光主要位于核；核质RNA分离后定量显示FSH增加两部分的circARHGAP21而LMB降低其核与胞质丰度，FSH降低两部分gga-miR-146a-5p而LMB使其升高，FSH亦增加核与胞质DEAF1 mRNA而LMB降低核DEAF1 mRNA。3.4 转染oe-circARHGAP21构建体增加FSHR与PCNA表达并降低CASP3表达与凋亡：通过连接位点靶向qRT-PCR检测构建体转染后靶信号升高，与空载体对照相比构建体转染增加FSHR与PCNA mRNA并降低CASP3 mRNA，PCNA蛋白升高而CASP3蛋白降低，流式细胞术证实凋亡比例降低。3.5 gga-miR-146a-5p mimic抑制circARHGAP21报告基因活性并减弱构建体相关效应：通过报告基因实验显示mimic抑制野生型circARHGAP21报告基因活性而不抑制结合位点突变型，mimic转染降低FSHR与PCNA mRNA并升高CASP3 mRNA，降低PCNA蛋白而升高CASP3蛋白，流式细胞术显示凋亡增加，mimic共转染减弱oe-circARHGAP21构建体相关标志表达与凋亡变化。3.6 gga-miR-146a-5p抑制DEAF1而DEAF1过表达增加FSHR表达并降低凋亡：通过生物信息学预测DEAF1 3′ UTR中gga-miR-146a-5p结合位点，mimic抑制野生型DEAF1 3′ UTR报告基因活性而不抑制突变型，并降低DEAF1 mRNA与蛋白丰度；DEAF1过表达增加FSHR与PCNA mRNA、降低CASP3 mRNA，升高PCNA蛋白、降低CASP3蛋白，并显示较少凋亡。3.7 LMB处理改变转染oe-circARHGAP21构建体GCs的标志表达与凋亡：通过比较空载体、构建体及构建体联合LMB组，构建体转染增加DEAF1 mRNA而构建体联合LMB组DEAF1 mRNA低于仅构建体组，构建体转染增加FSHR与PCNA mRNA并降低CASP3 mRNA，构建体联合LMB组较仅构建体组FSHR与PCNA mRNA更低、CASP3 mRNA更高，流式细胞术显示构建体组凋亡比例低于空载体对照而构建体联合LMB组高于仅构建体组。
讨论部分总结：卵泡选择需要母鸡卵巢内GC分化与存活，在既有FSH/FSHR信号框架内，该模块将FSH应答性RNA表达与GC存活相联系，整合转录组筛选与报告基因及细胞扰动实验为研究该关系提供功能基础。核质运输提供空间层面基因调控，CRM1/XPO1为主要蛋白输出通路，DEAF1已知定位、LMB敏感输出信号与细胞功能使其成为相关候选；FSH/LMB筛选鉴定对FSH及FSH处理背景下LMB添加响应的RNA，为候选选择提供药理学背景，但CRM1与DEAF1的已知特性仅支持该方法而非确立本实验中CRM1依赖调控。circRNA可通过多种分子互作参与RNA介导调控，circARHGAP21的胞质定位与序列依赖报告基因响应符合miRNA相关调控作用；总miRNA丰度降低可能反映生成或周转改变及间接调控，其本身不能确立内源miRNA竞争，所提模块为检验circARHGAP21如何影响gga-miR-146a-5p活性与DEAF1表达提供框架。卵巢miRNA调控GC表型，miR-146a-5p与鸡GCs中AKT信号及生殖功能相关，将DEAF1鉴定为靶标使该miRNA与GCs中另一候选效应物相联系；既往禽类与哺乳动物GCs中circRNA研究考察发育、环境与应激相关调控，鸡GCs中circRPS19/miR-218-5p/INHBB与增殖及类固醇生成相关，gga-miR-30b-5p/NR5A2与就巢鸡萎缩卵巢凋亡相关，另一闭锁相关网络中circRALGPS2经miR-200a-3p/TGFβ2/SMAD通路促进GC凋亡与自噬；与上述促凋亡关联相反，本研究中oe-circARHGAP21构建体转染与凋亡降低相关，所提模块以其DEAF1靶标与FSH/LMB指导的鉴定为特征，在探索性调控模型中连接激素应答性RNA表达与GC存活。GC存活与FSH应答性获得是卵泡发育互补方面，FSHR为卵泡选择分子标志，在6–8 mm队列中推定的选择卵泡内检测到其表达升高；BMP4亦维持FSHR表达并使前等级GCs中FSH诱导的cAMP与孕酮生成成为可能，这些发现将FSHR表达与促性腺激素应答性获得相联系并支持将FSHR变化解释为选择相关分子反应；Annexin V-FITC/PI测量提供功能性凋亡终点，FSHR、PCNA与总CASP3表达提供互补分子背景，PCNA丰度非直接增殖测量，总CASP3丰度不测量caspase-3活化。研究设计界定所提模型范围：功能转染结果归于oe-circARHGAP21构建体而非特指其circRNA产物，需连接位点测序与构建体衍生RNA种类的直接表征以区分环状与线性贡献，内源必要性、miRNA竞争与DEAF1依赖介导亦需直接检验；DEAF1蛋白成像与分离RNA测量描述定位与回收部分丰度，无区室纯度对照则不能确立定量再分布或区室间运输；无仅LMB与空载体联合LMB对照，所观察LMB响应不能区分一般药物效应与FSH或oe-circARHGAP21构建体互作；处理特异性参考基因稳定性亦需谨慎，每条件三个生物学重复限制精度与评估分布假设的效力。在此范围内，表达、报告基因与细胞发现支持对候选模块在FSH应答性RNA调控与GC存活中的进一步研究。研究结论部分翻译为：整合转录组筛选与细胞扰动实验鉴定出一个候选circARHGAP21/gga-miR-146a-5p/DEAF1模块，该模块与鸡GCs中FSH调控表达相关；转染oe-circARHGAP21构建体增加FSHR与PCNA表达并降低凋亡，而miRNA mimic共转染与DEAF1过表达为所提调控模型提供互补支持；LMB比较描述了所测试处理背景下的药物相关表达与表型变化；综上，上述发现鉴定出一个将FSH应答性RNA表达与GC存活及卵泡选择相关分子反应相联系的候选网络。
