《Foods》：Comprehensive Toxicological Evaluation and Safety Assessment of Perilla frutescens Leaf Extract: Repeated-Dose Oral Toxicity and Genotoxicity Studies
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研究人员对紫苏（*Perilla frutescens* var. *frutescens*）叶提取物（PFE）开展了符合良好实验室规范（GLP）的非临床安全性评价。既往临床研究已证实该提取物具有缓解膝关节不适的功效。为明确其安全性特征，研究人员依据经济合作与
研究人员对紫苏（*Perilla frutescens* var. *frutescens*）叶提取物（PFE）开展了符合良好实验室规范（GLP）的非临床安全性评价。既往临床研究已证实该提取物具有缓解膝关节不适的功效。为明确其安全性特征，研究人员依据经济合作与发展组织（OECD）试验指南开展了系列毒理学研究。在急性口服毒性试验中，PFE的急性口服半数致死剂量（LD50）截止值估计大于2000 mg/kg。在剂量高达5000 mg/kg/天的28天与90天重复给药口服毒性研究中，未观察到死亡、毒性体征或体重的不良变化。5000 mg/kg/天剂量下出现的轻微血液学/生化学指标改变及器官重量增加缺乏组织病理学相关性，且在28天恢复期后基本可逆，据此确定未观察到有害作用剂量（NOAEL）为5000 mg/kg/天。此外，细菌回复突变试验、体外染色体畸变试验及体内骨髓微核试验均未显示PFE具有致突变、致断裂或致非整倍体潜能。上述结果证明PFE具有宽泛的安全边界，支持其作为功能食品配料及营养保健品的安全应用。
**一、研究背景与问题提出**
紫苏（*Perilla frutescens* (L.) Britton，唇形科）是原产于东亚并在韩国、中国、日本广泛栽培的传统药用草本与食用植物。依据形态与区域利用方式，紫苏可分为不同亚种：紫苏原变种（*P. frutescens* var. *frutescens*，即韩国紫苏或deulkkae）主要用于食用种子油与叶菜，富含α-亚麻酸、酚类化合物与黄酮类；而皱叶紫苏（*P. frutescens* var. *crispa*，即shiso或cha-jo-ki）则富含紫苏醛等挥发性单萜类及红色花青素色素。紫苏原变种叶具有抗炎、抗氧化及抗过敏作用。近年来，以天然植物来源开发功能食品与营养保健品以管理慢性炎症性疾病日益受到关注。虽然紫苏作为全食物具有长期安全食用历史，但现代营养保健应用常使用富集特定生物活性标志物的高浓度提取物，传统膳食使用的安全性特征不能直接外推至治疗剂量下长期摄入此类浓缩植物提取物，慢性暴露于浓缩植物化学物可能带来未预见的全身毒性、靶器官损伤或遗传毒性风险。因此，亟需依据OECD等国际公认监管标准开展严格毒理学评价。研究人员此前已证实标准化PFE在缓解轻度膝关节不适方面具有临床疗效，但其安全性尚未在完全符合国际监管指南的条件下得到系统研究。为此，本研究通过符合GLP的非临床实验全面评价PFE的安全性，旨在为其治疗与膳食开发提供明确的毒理学证据并确立安全剂量窗口。
**二、主要关键技术方法**
研究人员采用符合GLP及OECD指南的标准毒理学组合：（1）OECD 423急性经口毒性试验（急性毒性分级法，雌性SD大鼠，2000 mg/kg单次灌胃）；（2）OECD 407 28天重复给药毒性试验（SD大鼠，800、2000、5000 mg/kg/天）；（3）OECD 408 90天重复给药毒性试验并设28天恢复期（100只SD大鼠，含恢复组）；（4）OECD 471细菌回复突变试验（Ames试验，4株鼠伤寒沙门菌及1株大肠杆菌WP2 uvrA，±S9代谢活化）；（5）OECD 473体外哺乳动物染色体畸变试验（中国仓鼠肺CHL/IU细胞）；（6）OECD 474哺乳动物骨髓红细胞微核试验（雄性SD大鼠，1250、2500、5000 mg/kg/天连续2天）。实验动物为7–8周龄SPF级雌性/雄性Sprague–Dawley [Crl:CD(SD)]大鼠，购自韩国Orient Bio, Inc.；受试物PFE所用紫苏叶原料于2023年9月与2024年7月采自韩国金堤市万顷邑当地农场栽培植株，经ITS与psbA-trnH序列鉴定（GenBank登录号MH710687.1、OR567250.1），以70%乙醇1:10（w/v）提取48 h，经减压浓缩与冷冻干燥制得标准化粉末（得率7.0%），主要标志成分为迷迭香酸（115.40 mg/g），另含咖啡酸（26.79 mg/g）、芹菜素-7-糖苷（17.37 mg/g）与木犀草素-7-糖苷（3.68 mg/g）。
**三、研究结果**
**3.1 急性口服毒性** 以2000 mg/kg限量剂量序贯给药后，14天观察期内无死亡、濒死或治疗相关全身毒性体征；第二组2只动物第4天出现轻微一过性体重下降，第8天恢复增重；第15天终末剖检未见肉眼病变。据此按GHS标准将PFE归类为第5类或未分类。
**3.2 28天重复给药口服毒性** 各剂量组均无死亡或濒死；所有给药组自第2天至第29天出现剂量依赖性深棕色粪便（受试物着色），高剂量组出现轻微流涎，均判为非不良的生理性反应。雄性体重增量呈剂量依赖性下降（第28天分别降低12.5%、13.6%、23.1%），但无统计学显著性且处于设施历史对照范围；雌性体重增量未受影响，摄食量无治疗相关不良变化。血液学与临床生化学未见治疗相关显著不良改变，仅雄性5000 mg/kg组A/G比值升高而总蛋白与白蛋白未变，判为无毒理学意义。绝对器官重量无显著变化，雄性5000 mg/kg组肾脏与肺相对重量轻度升高，归因于终末体重下降且无病理或血清化学改变；剖检未见肉眼病变。
**3.3 90天重复给药口服毒性** 100只大鼠给药期间无死亡或濒死；各给药组出现深棕色粪便，高剂量组出现流涎，二者在28天恢复期内完全恢复。体重、增重及摄食量与对照组无统计学或毒理学显著差异。血液学见雄性5000 mg/kg组RBC及雄雌性HGB/HCT剂量依赖性轻度降低；生化学见ALP（雄性5000 mg/kg、雌性≥2000 mg/kg）与BUN（雄性≥2000 mg/kg）升高；上述临床病理改变在恢复期完全消退且无组织病理学相关性。主研究组高剂量雄雌性肝、肾重量显著增加，雄性2000 mg/kg组肺重量增加、前列腺（含精囊/凝固腺）重量降低；恢复组器官重量改变多回复至对照水平，仅雌性5000 mg/kg组右肾重量轻度残留升高；大体剖检与组织病理学检查未见治疗相关病变，轻微组织学所见为自发性或偶发性，对照组与高剂量组频率与程度相似。
**3.4 细菌回复突变试验** 在至5000 μg/皿（原文标注为mg/plate，应为笔误）浓度、±S9条件下，各菌株均未见剂量依赖性回复突变菌落数增加，亦无细胞毒性或背景菌苔抑制；阳性对照诱变剂显示预期显著增高（3.8–32.3倍）。
**3.5 体外哺乳动物染色体畸变试验** 在6 h（±S9）、18 h恢复及24 h连续处理条件下，各浓度均未显著或剂量依赖性增加结构或数目畸变中期细胞数（p > 0.05），结构畸变率（0.00–0.33%）处于历史对照限值（0.00–2.00%）内；阳性对照显示预期显著增高（5.33–10.00%，p < 0.01）。
**3.6 哺乳动物骨髓红细胞微核试验** 连续2天给药后24 h，各剂量组微核嗜多染红细胞（MNPCE）频率无统计学或剂量依赖性增加（对照组0.83 ± 0.75 vs. 1250、2500、5000 mg/kg/天组分别为1.83 ± 1.83、1.67 ± 0.82、1.83 ± 0.98，p > 0.05），均在历史对照限值（0–4 MNPCE/4000 PCE）内；PCE:RBC比值不变（0.50 ± 0.01），提示无骨髓毒性；环磷酰胺阳性对照显著增加MNPCE（33.00 ± 5.44，p < 0.01）并降低PCE:RBC比值（0.38 ± 0.02，p < 0.01）。
**四、讨论与结论**
讨论部分指出，PFE虽具有长期膳食使用历史及临床疗效，但此前未在完全符合国际监管指南条件下系统评价其非临床安全性。本研究在全部一般毒性试验中均未观察到治疗相关死亡、全身毒性体征或体重/摄食量不良改变；28天研究中雄性高剂量组23.1%的增重下降无统计学显著性，且未在样本量更大的90天研究中重现，结合临床化学、血液学与组织病理学无相关不良所见，判为非不良的一过性继发应激反应。90天研究中RBC/HGB/HCT降低及ALP、BUN升高伴肝、肾重量增加，但缺乏组织病理学改变且恢复期基本可逆，故5000 mg/kg/天下的上述改变判为非不良，NOAEL确定为5000 mg/kg/天。三项遗传毒性试验结果一致阴性，未发现致突变、致断裂或致非整倍体活性。研究人员还将PFE的安全性与HemoHIM G、HemoHIM、发酵柑橘皮提取物等其他植物提取物及文献报道的紫苏属提取物安全性资料进行比较，结果高度一致；并指出虽紫苏酮为已知牲畜肺毒素、紫苏醛与皮肤致敏相关，但本研究提取工艺中的减压浓缩（65–70 °C）与真空冷冻干燥可因高蒸气压而有效去除此类挥发性单萜。研究结论为：本研究首次提供了标准化紫苏原变种叶提取物符合GLP的综合安全性评价，PFE无急性口服毒性，无致突变、致断裂或致非整倍体活性证据，28天与90天重复给药研究的口服NOAEL均为5000 mg/kg/天；结合其宽泛安全边界与已证实的临床关节保护功效，上述确凿毒理学证据支持PFE作为功能食品或营养保健品配料进一步开发的安全性。
