多环芳烃混合物与妊娠期铁缺乏的关联：基于遵义出生队列的横断面分析

《Nutrients》：Association of Polycyclic Aromatic Hydrocarbon Mixtures with Gestational Iron Deficiency: A Cross-Sectional Analysis of the Zunyi Birth Cohort

　　

背景：母亲铁缺乏是妊娠期一种高患病率的营养障碍，对母体和胎儿健康均构成重大风险。尽管充足的膳食铁摄入和补充对于维持妊娠期铁平衡至关重要，但新出现的证据提示，暴露于环境污染物如多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs）可能破坏铁稳态并导致铁缺乏。然而，将产前PAH暴露与妊娠期铁缺乏联系起来的流行病学证据仍然有限，尤其是在低水平暴露人群中。本研究旨在探讨妊娠晚期个体及混合PAH暴露与铁缺乏优势比的关联。方法：研究人员对纳入多中心遵义出生队列的1717名孕妇进行了横断面分析，并测定了十种尿液PAH代谢物。采用逆概率加权（inverse probability weighting, IPW）的加权准二项逻辑回归估计单一污染物关联，并使用限制性立方样条模型评估剂量-反应关系。混合效应分别采用贝叶斯核机器回归（Bayesian kernel machine regression, BKMR）、加权分位数和（weighted quantile sum, WQS）回归和分位数g计算进行评估；这些混合模型未使用IPW拟合。结果：IPW分析显示，与尿液PAH代谢物最低三分位组的孕妇相比，最高三分位组中铁缺乏优势比显著升高的前三位代谢物为2-OHPhe（OR = 1.96，95% CI：1.46–2.63）、3-OHPhe（OR = 1.92，95% CI：1.43–2.58）和1-OHPhe（OR = 1.83，95% CI：1.36–2.45）。WQS回归发现显著的总体混合指数效应（β = 0.28，OR = 1.32，95% CI：1.11–1.57，p = 0.002），其中3-OHPhe（48.42%）、1-OHPhe（18.49%）和1-OHPyr（16.53%）占总混合权重份额最大。分位数g计算也检测到显著的总体正向混合关联（ψ = 0.13，95% CI：0.01–0.26，p = 0.040），以3-OHPhe（30.39%）、2-OHPhe（29.56%）和1-OHPyr（24.02%）为主要正向贡献者；这些百分比基于方向内归一化，与WQS权重百分比不可直接比较。BKMR表明，估计的混合关联从较低分位数的轻微负值单调增加至较高分位数的正值。结论：这些发现提供了新的证据，表明暴露于特定PAHs，无论是个体还是作为混合物，尤其是菲衍生物如3-OHPhe，与妊娠期铁缺乏优势比升高相关。鉴于横断面设计，这些发现应被视为假设生成性的，并需要在前瞻性研究中予以证实。

研究背景方面，铁缺乏是妊娠期最常见的营养障碍之一，主要归因于妊娠期血红蛋白合成对铁的需求增加2–3倍以及生理消耗升高。该状况以铁储备耗竭和血清铁蛋白水平降低为特征，中国约45.6%的孕妇受其影响，患病率明显高于妊娠期贫血。越来越多的证据表明，母亲铁缺乏与多种不良妊娠结局密切相关，包括母体合并症加重、低出生体重、早产和宫内生长受限。对胎儿而言，母体血清铁水平降低限制了经胎盘的铁转运，损害胎儿造血和氧供应，不仅增加宫内生长受限风险，还可能导致子代远期神经发育缺陷。此外，铁缺乏破坏血红蛋白合成和细胞能量代谢两个核心生理过程，驱动铁限制性红细胞生成并最终促进妊娠期贫血的发生。PAHs是普遍存在的持久性有机污染物，广泛分布于空气、水、土壤等环境介质中，主要来源于煤、石油和有机材料的不完全燃烧，人体暴露主要通过吸入、皮肤接触和膳食摄入途径。越来越多流行病学和毒理学研究表明，PAH暴露与免疫功能障碍、呼吸系统疾病、先天畸形、儿童认知障碍、抑郁障碍、心血管疾病和恶性肿瘤等多种健康危害相关。值得注意的是，新出现的证据提示PAHs可干扰全身和细胞铁稳态：含氧化官能团的PAH代谢物能够直接螯合细胞内铁并耗竭不稳定铁池，由此形成的铁复合物进一步通过Fenton反应触发活性氧（reactive oxygen species, ROS）过量产生；过量ROS氧化血清转铁蛋白，削弱其铁结合能力，从而扰乱全身铁循环。此外，PAH诱导的肺部炎症升高循环白细胞介素-6（interleukin-6, IL-6），启动全身急性期反应并上调肝脏铁调素（hepcidin）表达；铁调素增加抑制铁转运蛋白（ferroportin）介导的巨噬细胞和肠上皮细胞铁外排，导致铁螯合和生物利用度受损。迄今，将PAH暴露与铁状态联系起来的证据主要来自机制和毒理学研究，基于人群的调查尤其是孕妇人群的研究尚缺乏。妊娠是伴随铁缺乏高患病率的脆弱时期，对母体和胎儿均构成重大健康风险；孕妇因激素波动、代谢需求升高和肺通气量增加而对包括PAHs在内的环境毒物更为易感，可能进一步加剧铁缺乏的优势比。因此，探讨孕妇PAH暴露与铁代谢之间的关联具有重要公共卫生意义。既往机制研究提示PAHs可通过调节铁调素表达破坏铁稳态，但将PAH暴露与铁缺乏联系起来的直接人群流行病学证据仍然有限，特别是阐明PAHs对低PAH暴露地区妊娠居民全身铁状态影响的研究很少，慢性低剂量PAH暴露对母体铁储备的健康影响仍知之甚少。为填补这一研究空白，本研究基于遵义出生队列开展，该地区环境PAH暴露相对较低。研究以孕妇为易感人群，旨在探讨低水平产前PAH暴露是否与铁代谢改变和铁缺乏相关。研究测定了十种尿液PAH代谢物，并通过血清铁蛋白测定评估铁状态；应用限制性立方样条模型评估剂量-反应关系，同时采用贝叶斯核机器回归、加权分位数和回归和分位数g计算模型评估混合效应；进一步采用逆概率加权控制潜在混杂因素。研究结果将丰富PAH相关健康风险的流行病学证据，并为环境污染预防和孕妇针对性营养干预策略提供科学参考。

研究人员开展的研究为基于遵义出生队列的横断面分析。该队列于2020年5月至2022年4月在中国西南地区建立，最初纳入6583名孕妇，从遵义医科大学附属医院、遵义医科大学第二附属医院、湄潭县人民医院和习水县人民医院四家医疗机构招募。参与者按以下标准进一步筛选：自然受孕、单胎妊娠、永久本地居住且近期无搬迁计划、有尿液生物样本、完成现场面对面问卷访谈。在初筛阶段，排除2337名在妊娠早期或中期（即孕龄<28周，因而不属于妊娠晚期）提供尿液样本用于污染物检测的参与者；随后排除1986名PAH数据缺失者、433名血清肌酐数据缺失者、96名确诊地中海贫血者、6名关键协变量信息不完整者、8名妊娠期有主动吸烟史的孕妇，最终分析样本为1717名。所有参与者在入组前均提供书面知情同意书。研究方案经遵义医科大学伦理委员会批准（批准号[2019] H-005）。

关键技术方法方面（不超过250字）：研究基于遵义出生队列（2020年5月至2022年4月，中国西南地区四家医院，最终分析1717名孕妇）。采用气相色谱-串联质谱（GC–MS/MS）测定十种尿液PAH代谢物，以尿肌酐归一化作为主要校正方式并进行三种敏感性分析。妊娠28周后空腹采集静脉血，由医院临床实验室定量血清铁蛋白，以血清铁蛋白<30 μg/L定义妊娠期铁缺乏。采用两阶段稳定逆概率加权（IPW）的加权准二项逻辑回归估计单一污染物关联，限制性立方样条评估剂量-反应关系；混合效应分别采用BKMR、WQS回归和分位数g计算评估（未使用IPW）。

研究结果方面：3.1 研究人群特征——共纳入1717名孕妇，平均年龄27.01岁，采血和采尿时孕龄中位数为38周（IQR：33–39周），铁缺乏患病率为22.3%。未符合纳入标准的2529名女性基本特征见附表，其中344名（13.6%）存在铁缺乏。采用Spearman秩相关评估代谢物间相关性。十种PAH代谢物检测率范围为49.2%（4-OHPhe）至76.6%（2-OHFlu），后者肌酐校正浓度中位数也最高。各代谢物的检测限、加标回收率和日内/日间精密度汇总于附表。3.2 个体PAH代谢物与铁缺乏优势比——在10个独立代谢物特异性拟合中，稳定权重较温和，范围为0.43至2.23（中位数0.97；IQR：0.81–1.14），中位有效样本量约1636。加权使暴露三分位间最大标准化均值差（SMD）从0.42降至0.22；尽管加权后最大SMD略超过传统0.10阈值，但温和的权重和一致的敏感性分析表明任何残余不平衡对估计影响甚微。在主IPW逻辑回归（LOD/√2插补）中，最高三分位组（T3）有五种代谢物与铁缺乏优势比升高显著相关（相对最低三分位组T1）：1-OHPhe 1.83（95% CI：1.36–2.45）、2-OHPhe 1.96（95% CI：1.46–2.63）、3-OHPhe 1.92（95% CI：1.43–2.58）、1-OHPyr 1.63（95% CI：1.22–2.17）和2-OHFlu 1.43（95% CI：1.06–1.92）。所有五种关联在Benjamini–Hochberg校正后仍显著（FDR q < 0.05），并在三种LOD处理策略（LOD/√2插补、加权回归和随机插补）下稳健。限制性立方样条分析进一步显示异质性剂量-反应模式：1-OHPhe、2-OHPhe、3-OHPhe和1-OHPyr呈显著线性正关联（3-OHPhe非线性临界，非线性p = 0.050），2-OHFlu和9-OHFlu呈显著倒U型关联，其余四种代谢物无显著关联。3.3 与妊娠期铁缺乏相关的关键PAH组分及其贡献特征——分位数g计算显示PAH混合物与铁缺乏呈统计学显著正关联（ψ = 0.13，95% CI：0.01–0.26，p = 0.040）。在混合物内，3-OHPhe（30.39%）、2-OHPhe（29.56%）、1-OHPyr（24.02%）、1-OHPhe（15.96%）和2-OHNap（0.07%）为正向（即有害）贡献者，而9-OHFlu（26.69%）、1-OHNap（22.91%）、2-OHFlu（21.50%）、4-OHPhe（17.46%）、9-OHPhe（11.44%）显示负权重。在分位数g计算中，正向和负向权重分别归一化，因此每个百分比是其自身方向内的相对贡献（正向权重合计100%，负向权重合计100%），而非在整个混合物内，故这些值不能与WQS权重（如3-OHPhe的48.42%，在整个混合物内归一化）直接比较。WQS回归显示PAH混合物指数与妊娠期铁缺乏呈统计学显著正关联（β = 0.28，OR = 1.32，95% CI：1.11–1.57，p = 0.002）。WQS回归进一步突出3-OHPhe的主导作用，其占总混合权重的48.42%，其次为1-OHPhe（18.49%）和1-OHPyr（16.53%）。3.4 PAH混合物关联——两组分组后验纳入概率均较高（第1组0.979，第2组0.998），支持全部十种代谢物联合纳入模型；组内1-OHPyr（条件PIP = 0.989）和3-OHPhe（条件PIP = 0.828）条件纳入概率最高。保留抽样的有效样本量对回归系数为2674–4215（均值3578），但对核平滑参数（r；39–645，均值214）和变量选择指示符（delta；36–825，均值224）较低；后验摘要在保留链的前后两半之间一致。1-OHPyr（第75百分位 vs 第25百分位）的估计关联随着其他共暴露固定于递增分位数而增强，并在固定于第75百分位时最大。所有10种个体PAH代谢物的单暴露剂量-反应函数见补充图。代谢物的成对联合边际效应见补充图。估计的总体混合物暴露-反应关系（所有代谢物设定为相同分位数）显示跨分位数的单调方向趋势。在较低分位数范围（0.25至0.45），估计的铁缺乏关联持续为负，所有95%置信区间完全低于零。这些负估计仅反映较低分位数混合物与中位数参照的比较，不应解释为保护效应。关联在0.5参照点锚定于零，并在0.55分位数首次达到正向统计学显著性（估计值 = 0.056，95% CI：0.008–0.105）。该正关联的幅度在较高分位数上稳步单调增加，在第0.75分位数达到估计值0.267（95% CI：0.065–0.470）。此外，双变量暴露-反应分析提示1-OHPyr与3-OHPhe之间呈非可加性（协同）模式，每种代谢物的估计关联随共代谢物分位数增加而增加。该交互作用是从共代谢物不同分位数间剂量-反应曲线的分离推断的，符合非参数模型提示的统计交互作用，而非在可加尺度上量化的关联。

讨论部分总结：据研究人员所知，将尿液PAH代谢物与妊娠期铁缺乏联系起来的直接流行病学证据仍然稀少：既往人群研究主要在孕妇人群中表征PAH暴露水平或考察与氧化应激生物标志物的关联，而非铁状态结局。本横断面分析通过考察产前PAH暴露与妊娠晚期铁缺乏优势比升高之间的关联填补了这一空白。五种代谢物（1-OHPhe、2-OHPhe、3-OHPhe、2-OHFlu和1-OHPyr）与铁缺乏优势比升高显著相关；其中1-OHPhe、3-OHPhe和1-OHPyr是WQS模型中正向混合指数的主导统计贡献者。此外，总体混合关联可能受组分交互作用调节；提示3-OHPhe与1-OHPyr之间可能存在非可加性交互模式。在WQS回归分析中，3-OHPhe对铁缺乏优势比的贡献权重最高，其次为1-OHPhe和1-OHPyr。这些代谢物作为铁缺乏统计贡献者的生物学合理性得到现有毒理学机制的支持。作为3-OHPhe和1-OHPhe的母体化合物，菲可强烈诱导氧化应激，加剧妊娠期基础氧化负荷，并可能上调IL-6表达。流行病学研究表明PAH暴露与一般人群中循环促炎细胞因子包括IL-6升高相关，孕妇因对环境毒物的炎症反应增强而预期同样易感。IL-6是通过JAK2/STAT3信号通路刺激肝脏铁调素合成的强效刺激因子。正常妊娠中，血清铁调素浓度随孕龄进展而逐渐下降，以适应不断扩大的胎儿-胎盘单位显著增加的铁需求；这一生理性下降是增强肠道铁吸收和动员母体铁储备的关键适应。然而，研究人员推测PAH相关慢性炎症可能对抗铁调素的这一生理性下降。若IL-6水平因持续PAH暴露而不适当升高，肝脏铁调素合成可能持续上调，导致铁调素浓度高于该孕龄预期水平。升高的铁调素结合并诱导铁转运蛋白（唯一已知的表达于十二指肠肠上皮细胞、巨噬细胞和肝细胞的细胞铁输出蛋白）的内化和降解。由此产生的阻断有两个主要后果：十二指肠黏膜膳食铁吸收受损，以及巨噬细胞对衰老红细胞铁再循环受损。这些效应共同造成慢性铁限制状态，即进入循环的铁不足以满足妊娠不断升级的需求。在整个妊娠过程中，这种由不适当升高的铁调素驱动的持续铁限制可能逐渐侵蚀母体铁储备。尽管急性炎症通常作为急性期反应的一部分同时升高铁调素和铁蛋白，但妊娠的独特背景可能改变这一轨迹。若铁调素介导的铁吸收和再循环阻断在整个妊娠期持续，累积的慢性铁缺乏最终可能压过急性期铁蛋白反应，导致净铁储备耗竭，表现为低血清铁蛋白。因此，菲可能促进铁调素合成，进而抑制肠道铁吸收和巨噬细胞介导的铁再循环，最终触发功能性铁缺乏；同时，它直接破坏铁代谢和红细胞生成，进一步协同促进铁缺乏进展。这一解释得到肥胖孕妇证据的支持，后者表现为持续低度慢性炎症伴血清铁蛋白降低和矛盾性铁调素升高，与铁调素介导的铁吸收受损模式一致。此外，Weiss和Goodnough描述了纯铁缺乏与慢性病贫血之间公认的连续谱，其中长期炎症驱动的铁限制最终可耗竭机体铁储备，产生兼具两者特征的"混合"模式。然而，必须强调本研究未测定任何这些中间生物标志物。因此，氧化应激→IL-6→铁调素→铁转运蛋白通路应解释为将本流行病学发现与既往实验文献整合所产生的合理机制假设，而非本队列所证实的机制。未来需同时测定这些中间生物标志物的研究来验证该假设。本研究中分位数g计算显示某些PAH代谢物（如2-OHFlu和9-OHFlu）呈现潜在"保护效应"。然而，该结果应谨慎解释。观察到的"保护效应"可能归因于统计假象或残余混杂。首先，Q-g模型采用的总体平均加权可能掩盖真实的剂量依赖性变化，导致将低暴露水平下非显著毒性效应误释为保护性关联，而高PAH暴露水平下毒性效应仍然显著。分位数g计算中的负权重代表对其他共暴露调整后的条件性反向统计关联，不应解释为生物学保护效应。它们可能源于代谢物间共线性或残余混杂，而非归因于权重归一化（后者在各方向内分别应用）。其次，未测量或调整不充分的混杂因素，包括膳食抗氧化剂摄入、共存环境污染物、遗传易感性和PAH代谢物间共线性，可能扭曲PAH暴露与铁状态之间的真实关联。同样重要的是，2-OHFlu在单一污染物IPW模型中的正关联（T3 vs. T1，OR = 1.43，95% CI：1.06–1.92）与其在分位数g计算中的负权重并不矛盾：qgcomp权重是对其他九种代谢物相互调整后估计的条件贡献，而单一污染物OR是边际估计。在存在强代谢物间相关时，边际和条件估计方向可能不同；因此负权重应按照上述条件性反向统计关联解释，而边际正OR可能部分反映相关共暴露（如3-OHPhe和1-OHPhe）的混杂。在BKMR分析中，当所有PAH代谢物设定为相同分位数时，估计的铁缺乏关联单调增加。最高暴露水平下的正关联应谨慎解释，因置信区间较宽且观测较少。双变量BKMR分析提示1-OHPyr与3-OHPhe之间呈定性非可加性模式；由于BKMR是非参数的，这应解释为统计模式而非生物学协同的证据。这些代谢物共暴露可能放大氧化应激和炎症反应的假设源自既往实验文献，而非本队列的直接测量，本队列未评估任何氧化应激、炎症或铁调节生物标志物。本嵌入多中心出生队列的横断面分析提供了将PAH暴露与妊娠晚期（孕28周后）铁缺乏优势比升高联系起来的新流行病学证据，填补了重要知识空白。一个关键优势在于应用了前沿混合建模方法——包括BKMR、WQS回归和分位数g计算。这一稳健分析框架使研究人员能够解析真实世界PAH共暴露的复杂联合效应，确定3-OHPhe为正向WQS混合指数的主导统计贡献者，并提示1-OHPyr与3-OHPhe之间潜在的非可加性交互模式。研究进一步表征了从线性到倒U型的异质性剂量-反应关系。来自明确界定的出生队列的大样本量（n = 1717）以及采用多种敏感性分析处理不可检测值（LOD/√2替代、随机插补和加权回归）增强了本研究在该人群中的内部效度。从公共卫生角度看，3-OHPhe（一种与燃烧相关PAH暴露相关的菲代谢物）在WQS模型中的主导统计贡献提示，减少住宅燃烧来源PAH暴露可能与母体铁状态相关，尽管本研究未评估具体排放源。因此这些策略应视为假设生成性的，需要前瞻性评估。然而，本研究存在若干局限性应予承认。第一，单次妊娠晚期 spot 尿液样本可能反映近期而非累积妊娠期PAH暴露；尽管尿液PAH代谢物显示合理的短期至中期可重复性，但其对妊娠早期的代表性仍不确定。某些代谢物检测率低（如4-OHPhe：49.2%；2-OHFlu：76.6%）可能引入测量误差；尽管采用LOD/√2插补和替代截尾敏感性分析，此类发现仍需谨慎。第二，铁缺乏仅由血清铁蛋白<30 μg/L定义。单一污染物估计的E值范围为1.68至2.15（CI边界为1.20–1.71）；混合估计的E值分位数g计算为1.34（1.06），WQS为1.56（1.29）。这些值表明未测量混杂因素需与暴露和结局同时具有的最小联合关联才能将估计移至零；临界混合估计相应地更敏感，支持假设生成性解释。第四，大量检验引发假阳性担忧；FDR校正仅应用于主要个体代谢物趋势检验。此外，在BKMR模型中，某些变量选择指示符的有效样本量较低（低至36）：这些二元指示符高度自相关，且对很少被选择的代谢物保持为零。由于后验纳入概率是这些指示符的后验均值，弱选择代谢物的PIP带有更大的蒙特卡洛不确定性；因此研究人员不声称正式充分收敛，BKMR发现被视为定性且假设生成性的。第五，作为出生队列内的横断面分析，PAH代谢物和铁状态在单一时间点同时测量，无法进行确定性因果推断；研究结果对不同暴露特征人群或妊娠早期的普适性也需进一步研究。因此本研究发现应视为假设生成性的，需要独立队列证实。

结论部分翻译：这些发现提示，妊娠晚期暴露于五种PAH代谢物——1-OHPhe、2-OHPhe、3-OHPhe、2-OHFlu和1-OHPyr——与妊娠期铁缺乏优势比升高显著相关。三种混合方法在较高暴露水平上收敛于正关联——WQS和qgcomp检测到统计学显著的总体正向混合关联，BKMR表明估计关联在较高分位数变为正值——其中3-OHPhe在WQS和qgcomp中成为主导统计贡献者。总体而言，这些PAH代谢物——尤其是菲衍生物如3-OHPhe——可能是母体铁状态的相关标志物。这些发现提示住宅燃烧来源PAH暴露可能是母体铁状态的相关因素，尽管该横断面研究未确立因果关系，需要前瞻性证实。