《Nutrients》：Carica papaya L. Hexane Fraction Induces Apoptotic Cell Death in Colorectal Cancer Cells via PI3K/AKT Suppression and Impaired Late-Stage Autophagic Flux
背景/目的：结直肠癌（CRC）仍是全球癌症相关死亡的主要原因之一。番木瓜（Carica papaya L.）作为一种热带水果物种，据报具有广泛的生物学特性以及潜在的抗癌作用。然而，评估韩国番木瓜（Carica papaya L.）栽培品种对CRC的治疗潜力及分子机制的研究仍有限。因此，本研究探讨了番木瓜（Carica papaya L.）己烷组分在人CRC细胞中诱导凋亡的作用及其相关机制。方法：研究人员开展了多项体外实验，包括细胞活力、凋亡、自噬泡评估、Western blotting及自噬流分析。随后，研究人员在氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸钠诱导的CRC动物模型中验证了上述发现。结果：BR 56 Hex F降低细胞活力，并诱导依赖caspase-7/9的凋亡，伴随细胞内及线粒体活性氧（ROS）升高。在机制上，BR 56 Hex F抑制磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K；p85/p110）、p-AKT（Ser473/Thr308）及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号。尽管自噬体形成被启动，但晚期自噬流受损，表现为p62蓄积、LAMP-1耗竭及自噬体积累。在体内，口服给予BR 56番木瓜（C. papaya L.）提取物显著减轻氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸钠诱导的结肠缩短、脾肿大、组织病理学损伤及结肠PI3K和p-AKT表达。结论：BR 56 Hex F通过抑制PI3K/AKT信号并损害晚期自噬流抑制CRC生长，代表一种潜在的CRC治疗天然候选物。
结直肠癌（CRC）是全球重大的公共卫生挑战之一。尽管手术、化疗、靶向药物和免疫治疗已应用于临床管理，但其疗效可能受到不良反应的限制。CRC随局部病变进展为转移性疾病而经历四个主要临床阶段，肿瘤细胞通过循环播散至全身远处器官。当前治疗策略包括手术切除、化疗、靶向治疗和免疫治疗，然而这些方法的临床有效性可能受到治疗相关副作用、肿瘤异质性及耐药性发展的限制，凸显了开发具有新作用机制和更佳疗效的新型治疗药物的需求。因此，鉴定新型抗癌药物，尤其是来源于天然产物的药物，已引起广泛关注。天然产物是具有广泛药理作用的生物活性物质的宝贵来源，有望为应对结直肠癌（CRC）的分子复杂性提供新策略。
番木瓜（Carica papaya L.）是番木瓜科热带水果作物，原产于热带美洲，现已在包括亚洲和非洲在内的世界范围内栽培。该果实因其营养、药用和健康益处而受到重视。温度、光照、降雨和土壤条件等环境因素强烈影响番木瓜生长及植物化学成分。最适气候（21–33 °C）、充足光照和营养丰富土壤有助于有益化合物的积累，而温度胁迫和水分缺乏可能降低产量并降解敏感营养素。尽管番木瓜栽培已通过温室生产扩展至日本和韩国等非热带地区，但受控栽培条件对果实品质和植物化学特性的影响尚未得到充分评估。番木瓜果实因其多样的生物活性成分而受到认可，这些成分已被证明具有多种药理益处，包括抗氧化、抗炎、抗癌、抗菌、抗衰老、抗糖尿病、抗肥胖和伤口愈合活性。此外，多项研究报道了番木瓜提取物的抗癌潜力；然而，其潜在分子机制，特别是关于自噬调控及CRC进展中涉及的致癌信号通路，仍相对研究不足。
在结直肠肿瘤发生相关的信号通路中，磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信号级联在结直肠肿瘤发展中常发生失调，导致不受控的增殖、凋亡抵抗、代谢重编程和化疗耐药。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）是一种细胞内磷脂酰肌醇激酶，由细胞表面受体激活以产生第二信使，进而激活下游蛋白激酶B（AKT）。AKT磷酸化进一步促进雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的激活并触发肿瘤增殖和进展。因此，PI3K/AKT/mTOR通路已被记录为主要的抗肿瘤靶点。PI3K/AKT/mTOR信号级联是自噬的重要调节因子，将支持肿瘤细胞存活的通路与适应细胞应激的机制联系起来。
自噬是一种细胞内降解通路，通过将受损蛋白质和细胞器递送至溶酶体进行降解和回收来维持细胞稳态。其在癌症生物学中发挥复杂作用，其失调，特别是通过阻断晚期自噬流，已成为触发癌细胞死亡的有效治疗策略。自噬体–溶酶体融合中断或溶酶体降解受损导致细胞碎片、受损线粒体、自噬体、泛素化蛋白聚集体及自噬受体p62/SQSTM1的毒性蓄积，从而促进细胞应激，并在某些情况下促进凋亡性细胞死亡。因此，PI3K/AKT信号与自噬调控之间的相互作用与癌症治疗尤为相关。抑制PI3K/AKT/mTOR信号可作为细胞适应机制刺激自噬反应，而晚期自噬降解受损可阻止自噬过程的完成，从而将该保护性反应转化为细胞毒性机制。因此，能够同时抑制PI3K/AKT信号并破坏自噬流的化合物可能为诱导CRC细胞死亡提供有效策略。
尽管对番木瓜生物活性已有广泛研究，但韩国本土栽培番木瓜品种溶剂组分的抗癌潜力仍未知。具体而言，韩国栽培的番木瓜（C. papaya L.）品种是否通过调控PI3K/AKT信号轴和自噬流在CRC中发挥抗癌作用仍不清楚。因此，本研究考察了从韩国栽培的未成熟（绿色）番木瓜（C. papaya L.）品种BR 56制备的己烷组分（BR 56 Hex F）的抗癌活性。研究人员系统评估了BR 56 Hex F对人CRC细胞（HT-29和HCT-116）的抗增殖和促凋亡作用，特别关注其抑制PI3K/AKT信号和诱导晚期自噬流阻断的能力。比较成熟（BR 56 Yellow）和未成熟（BR 56 Green）果实组分的初步细胞活力筛选显示，BR 56 Green己烷组分在所测试组分中对HT-29细胞的细胞毒性活性最高。因此，选择未成熟果实（BR 56 Green）己烷组分用于所有后续体外实验。
材料与方法部分：未成熟番木瓜（C. papaya L.）果实于2024年8月至10月间在完全成熟前采收，获自韩国农村振兴厅国立园艺特作科学院气候变化与农业研究所（济州，韩国）。果实来自品种开发过程中暂定命名为BR 56的番木瓜育种品系。BR育种品系源自玻利维亚番木瓜与Redlady的人工杂交，数字后缀表示单株标识。未成熟果实被命名为BR 56 Green。为永久追溯和参考，代表性干燥植物标本和保留的提取物样品编目并保存于济州国立大学生物制药材料研究实验室标本库，凭证/参考编号为JNU-2024-BR 56(G)。
新鲜番木瓜（C. papaya L.）果实经冷冻干燥并粉碎成细粉。取100 g粉末材料用2 L 70%（v/v）乙醇在持续搅拌下提取24 h。所得悬浮液经ADVANTEC No. 2滤纸过滤，收集的滤液用维持于50 °C的旋转蒸发仪浓缩。浓缩提取物重新分散于100 mL蒸馏水中，并按溶剂极性递增顺序用100 mL正己烷、乙酸乙酯和正丁醇进行顺序液–液分配。各有机组分经50 °C旋转蒸发浓缩，随后在氮气流下干燥。该程序产生粗乙醇提取物、正己烷、乙酸乙酯和正丁醇组分及剩余水相组分。各组分别溶于DMSO至100 mg/mL浓度备用。从BR 56番木瓜育种品系未成熟果实获得的正己烷组分以下称为BR 56 Hex F。
药物方面：N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC；货号A7250）、羧甲基纤维素钠（货号C9481）和5-氟尿嘧啶（5-FU；货号F6627）购自Sigma-Aldrich公司。氯喹（货号HY-17589A）、Z-VAD-FMK（货号HY-16658B）和巴弗洛霉素A1（BafA1）购自MedChemExpress公司。BafA1、Z-VAD-FMK和氯喹的储备液以二甲基亚砜（DMSO）配制。NAC重悬于蒸馏水（pH 7.5），5-FU在给药前即时溶于无菌磷酸盐缓冲液（PBS）。
细胞培养：HT-29和HCT-116人结直肠癌细胞购自韩国细胞库（KCLB，首尔，韩国）。常规维持时，细胞培养于含10%（v/v）胎牛血清和1%（v/v）青霉素–链霉素的RPMI培养基中，于37 °C、5% CO
2加湿培养箱中生长和维持。
细胞活力测定：细胞以1.5 × 10
5 cells/mL密度接种并培养48 h，再用BR 56 Hex F处理24 h。处理后使用EZ-CYTOX细胞活力试剂按制造商方案评估细胞活力，用SpectraMax iD5酶标仪于450 nm记录吸光度。
凋亡测定：使用APC Annexin V/碘化丙啶（PI）凋亡检测试剂盒按制造商说明，通过流式细胞术分析BR 56 Hex F处理后的凋亡细胞群。每样本至少获取5000个事件，使用BD Accuri C6流式细胞仪采集，数据用BD Accuri C6软件分析。
Hoechst染色：BR 56 Hex F处理指定时间后，细胞与Hoechst 33342（1 μg/mL）在室温避光孵育15 min，随后用Lionheart FX相差荧光显微镜采集图像。
Cyto-ID自噬泡评估：细胞以1.5 × 10
5 cells/mL维持48 h后暴露于BR 56 Hex F。处理后使用CYTO-ID?自噬检测试剂盒标记自噬相关囊泡，于37 °C避光孵育30 min，用Lionheart FX成像系统检测自噬泡荧光信号。
Western blotting：去除培养基后，细胞用冰冷PBS（pH 7.4）洗涤两次。使用补充氟化钠（NaF）、原钒酸钠（Na
3VO
4）和蛋白酶抑制剂混合物的放射免疫沉淀 assay（RIPA）缓冲液提取细胞蛋白。裂解液冰上放置15 min，4 °C以15,000 rpm离心10 min。收集上清用BCA蛋白检测试剂盒进行蛋白定量。等量总蛋白样品经SDS-PAGE按分子量分离并转移至PVDF膜。为减少非特异性抗体结合，膜与EzBlock Chemi溶液室温孵育30 min，随后与相应一抗于4 °C过夜孵育。洗涤后，膜与IRDye 680RD山羊抗小鼠IgG或IRDye 800CW山羊抗兔IgG二抗孵育1 h。免疫反应条带用Odyssey CLx成像系统检测和定量。所用一抗包括抗caspase-7（9492S）、caspase-9（9502S）、caspase-3（9662S）、SQSTM1/p62、LC3A/B（D3U4C）、PI3 kinase p85（19H8）、phospho-AKT（Ser473；D9E）XP、phospho-AKT（Thr308；D25E6）XP和AKT（9272），均购自Cell Signaling Technology（CST）；PI3 kinase p110α抗体（A22730）购自ABclonal Technology；抗β-actin和LAMP-1（H4A3）抗体购自Santa Cruz Biotechnology。
细胞和线粒体ROS检测：细胞以1.5 × 10
5/mL接种于96孔板维持48 h后暴露于BR 56 Hex F。处理后分别使用CellROX Green和MitoSOX Red荧光探针检测细胞内活性氧（ROS）和线粒体超氧化物。细胞内ROS检测时，细胞与CellROX Green于37 °C避光孵育30 min。线粒体超氧化物使用MitoSOX Red按制造商方案于37 °C避光孵育30 min评估。荧光信号用Lionheart FX相差荧光显微镜检测。
自噬流分析：细胞使用Lipofectamine 3000瞬时转染mRFP-GFP-LC3报告质粒（Addgene，质粒#21074）。转染48 h后，细胞接受指定处理24 h，随后用4%多聚甲醛固定。LC3阳性斑点及其荧光信号用Lionheart FX成像系统检测。
小鼠：5周龄雄性ICR小鼠购自认证实验动物供应商，实验前适应7天。动物饲养于受控环境条件，温度22 ± 2 °C，相对湿度50–60%，12 h光/12 h暗循环，标准饲料和饮水自由获取。动物护理和实验程序符合适用动物福利指南。研究方案经济州国立大学动物伦理委员会审查批准（批准号2025-0018）。
AOM/DSS动物模型建立：适应一周后，小鼠（n = 10/组）随机分配至四个实验组：（1）阴性对照、（2）氧化偶氮甲烷（AOM）/葡聚糖硫酸钠（DSS）对照、（3）BR 56番木瓜（C. papaya L.）提取物、（4）阳性对照。在AOM/DSS模型中诱导结肠炎相关CRC。第3周，小鼠单次腹腔注射氧化偶氮甲烷（AOM；10 mg/kg体重）。间隔7天后，饮用水中给予2%（w/v）葡聚糖硫酸钠（DSS）7天，随后正常饮水14天。该DSS给药和恢复方案重复三个循环以建立慢性结肠炎症并促进结直肠肿瘤发展。小鼠自AOM注射日（第3周）开始经口灌胃给予BR 56番木瓜（C. papaya L.）果实提取物（i.g.，400 mg/kg/天），每日持续至14周实验期结束。阴性和AOM/DSS模型对照组接受等体积0.5% CMC-Na作为赋形剂对照。阳性对照组腹腔注射5-氟尿嘧啶（5-FU）35 mg/kg，每周两次。研究期间每周监测体重、直肠出血和临床体征。每周收集新鲜粪便样品用于后续分析。第14周，按机构动物护理指南通过逐渐暴露于二氧化碳（CO
2）处死小鼠。处死后仔细切除结肠、盲肠和脾脏。测量结肠长度并评估肿瘤数量和大小，随后进行组织病理学和分子分析。收集盲肠和脾脏，称重并保存用于组织学和生化分析。
统计学分析：所有体外实验进行三次独立生物学重复（n = 3）。所有数据以均值 ± SD表示。数据采用单因素方差分析（ANOVA）结合Dunnett多重比较检验或双因素ANOVA结合Tukey多重比较检验。p值表示如下：* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001，**** p < 0.0001，p ≥ 0.05视为不显著（ns）。所有数据使用GraphPad Prism 8软件分析。
结果部分：
3.1. BR 56番木瓜己烷组分诱导结肠癌细胞凋亡性细胞死亡
使用WST assay检测不同浓度BR 56己烷组分处理后HT-29结肠癌细胞活力，结果显示HT-29细胞呈浓度依赖性抑制。因此，后续实验使用125、250和500 μg/mL的BR 56 Hex F浓度。接着，研究人员使用Annexin V和碘化丙啶（PI）双染检测不同浓度BR 56 Hex F诱导的凋亡。250 μg/mL BR 56 Hex F处理使凋亡细胞群轻微增加至12.9%，而500 μg/mL处理进一步使凋亡细胞百分比增至17.6%（相较于对照细胞）。这些结果表明BR 56 Hex F以浓度依赖性方式诱导凋亡，提示凋亡是BR 56 Hex F诱导细胞毒性的主要机制之一。使用Hoechst 33342染色评估BR 56 Hex F处理后HT-29细胞核形态。未处理细胞维持完整细胞核，染色质分布均匀（NC）。相反，BR 56 Hex F处理细胞呈浓度依赖性增加染色质凝聚（CC）和核碎裂（NF）。这些核异常进一步支持BR 56 Hex F在HT-29细胞中诱导凋亡。为进一步探究BR 56 Hex F诱导凋亡的分子机制，进行Western blot分析检测cleaved PARP、caspase-3、caspase-9、cleaved caspase-9、caspase-7和cleaved caspase-7表达，从而评估caspase依赖性凋亡信号的参与。BR 56 Hex F处理显著增加cleaved PARP表达，尤其在500和750 μg/mL时。Western blot分析显示所有处理组均存在全长caspase-9和caspase-7。相反，其剪切形式的丰度在BR 56 Hex F处理后呈浓度依赖性显著增加。同时，全长caspase-3蛋白水平保持稳定。这些发现提示BR 56 Hex F诱导的细胞死亡与PARP剪切相关，并涉及caspase-9和caspase-7的激活，而caspase-3的参与似乎有限。随后，HT-29细胞在暴露于BR 56 Hex F前用20 μM Z-VAD-FMK（泛caspase抑制剂）预处理1 h，以进一步确认caspase依赖性凋亡在BR 56 Hex F细胞毒性活性中的参与。Z-VAD-FMK在整个处理期间维持终浓度20 μM。处理24 h后评估细胞活力。Z-VAD-FMK显著减轻250、500和750 μg/mL BR 56 Hex F诱导的细胞活力丧失，将细胞活力分别从约73%、70%和66%提高至91%、86%和80%。这些结果表明抑制caspase活性部分挽救BR 56 Hex F诱导的细胞毒性，支持caspase依赖性凋亡参与BR 56 Hex F的抗肿瘤活性。
3.2. BR 56番木瓜己烷组分诱导结肠癌细胞氧化应激
使用CellROX荧光染色评估细胞内ROS水平。BR 56 Hex F暴露后CellROX Green荧光呈浓度依赖性增加，提示细胞内活性氧（ROS）蓄积增强。125 μg/mL时观察到可检测的增加，250和500 μg/mL时荧光进一步增加，提示氧化应激逐渐增强。为考察ROS在该反应中的参与，细胞在BR 56 Hex F暴露前用10 mM NAC预处理2 h。与单独BR 56 Hex F处理相比，NAC预处理大幅减弱荧光强度，支持ROS参与BR 56 Hex F诱导的氧化应激。BR 56 Hex F暴露后CellROX荧光增加及其被NAC预处理减弱，提示氧化还原失衡参与HT-29细胞中观察到的细胞反应。随后，进行MitoSOX Red染色观察BR 56 Hex F处理后HT-29细胞线粒体超氧化物生成。与未处理对照相比，MitoSOX荧光随BR 56 Hex F浓度增加而显著增加，表明线粒体超氧化物蓄积增强。为进一步确认ROS参与BR 56 Hex F诱导的细胞毒性，细胞在BR 56 Hex F暴露前用ROS清除剂（NAC，10 mM）预处理2 h。与单独BR 56 Hex F处理相比，NAC显著增加细胞活力，表明BR 56 Hex F诱导的细胞毒性部分恢复。这些发现表明BR 56 Hex F引起ROS产生，且用NAC清除ROS可减弱BR 56 Hex F诱导的细胞毒性，支持氧化应激在观察到的细胞毒性中的潜在参与。
3.3. BR 56番木瓜己烷组分通过溶酶体降解诱导自噬流阻断
进行Cyto-ID染色监测BR 56 Hex F处理后自噬活性，该染料标记前自噬体和自噬体。氯喹（CQ）作为阳性对照，为已知的晚期自噬抑制剂。与显示弱绿色荧光的未处理细胞相比，暴露于BR 56 Hex F的细胞显示绿色荧光斑点显著浓度依赖性增加。CQ处理细胞也显示绿色荧光增加，与自噬阻断受损一致。这支持BR 56 Hex F通过损害自噬流诱导自噬体蓄积。为进一步表征潜在机制，通过Western blotting检测自噬相关蛋白表达。BR 56 Hex F在125、250和500 μg/mL时导致mTOR表达降低。mTOR是一种调节自噬的营养感应激酶。这些发现表明BR 56 Hex F抑制mTOR并启动自噬。基于这些发现，研究人员进一步检查BR 56 Hex F对LC3-II转化的影响。BR 56 Hex F处理导致结肠癌细胞中LC3-II蛋白水平呈剂量依赖性增加。p62结合泛素化蛋白并促进其递送至自噬机器进行降解。正常自噬条件下，p62水平通常因溶酶体降解而下降。因此，p62蓄积可能提示自噬流受损。BR 56 Hex F增加p62蛋白表达水平，提示BR 56 Hex F导致自噬通路晚期阶段受阻。为确定BR 56 Hex F的自噬相关效应是否超出HT-29细胞，在HCT-116细胞中进行相同分析。免疫印迹分析显示处理后mTOR蛋白水平降低，同时LC3-II和p62水平增加。这些发现与自噬调控改变及自噬降解可能受损一致。此外，BR 56 Hex F处理细胞中LAMP1表达显著降低，提示溶酶体功能或丰度可能改变。尽管各标志物变化幅度在细胞系间存在差异，但总体反应模式一致，支持BR 56 Hex F诱导的自噬相关过程改变在两种CRC细胞系中的可重复性。然而，这些标志物反应差异并未确定一种细胞系是否比另一种对BR 56 Hex F更敏感。
3.4. BR 56番木瓜（C. papaya L.）己烷组分损害HT-29结肠癌细胞自噬流
给予BafA1（一种众所周知的药理学自噬抑制剂）以进一步研究BR 56 Hex F是否损害自噬流。BafA1抑制液泡型H
+-ATP酶（V-ATPase），从而损害溶酶体酸化并损害溶酶体降解，导致晚期自噬阻断。在本研究中，单独BafA1处理增加LC3-II和p62水平，与降解阻断导致的自噬体蓄积一致。BR 56 Hex F与BafA1共处理24 h后，观察到LC3-II和p62蓄积显著大于单独BR 56 Hex F处理，支持自噬流受损的参与。这些结果表明BR 56 Hex F破坏自噬，可能发生在自噬体–溶酶体融合或溶酶体功能阶段。为进一步评估自噬流，细胞瞬时转染串联荧光mRFP–EGFP–LC3报告基因（ptfLC3），该报告基因能够区分自噬体与酸性自噬溶酶体区室。由于EGFP荧光对酸性条件敏感，而mRFP荧光相对稳定，自噬体显示绿色和红色荧光，在合并图像中呈黄色斑点。相反，仅红色斑点表示EGFP荧光被淬灭的酸性自噬溶酶体区室。BR 56 Hex F处理细胞显示黄色斑点丰度增加，伴随仅红色斑点相对减少。该模式提示非酸化自噬区室蓄积及向酸性自噬溶酶体区室推进减少。在氯喹（CQ）处理细胞中观察到类似分布，CQ作为溶酶体酸化和自噬降解受损的阳性对照。这些发现提示BR 56 Hex F可能损害晚期自噬加工，尽管需要进一步实验区分自噬体成熟、溶酶体融合和酸化缺陷。
3.5. BR 56番木瓜（C. papaya L.）己烷组分抑制结肠癌细胞PI3K/AKT信号通路
研究人员检测BR 56 Hex F对HT-29结肠癌细胞PI3K/AKT信号通路的影响，以探究其抗癌活性的分子机制。BR 56 Hex F（125、250和500 μg/mL）处理显著降低PI3K调节亚基和催化亚基表达，包括PI3K p85和PI3K p110，呈浓度依赖性。此外，BR 56 Hex F显著降低AKT在Ser473和Thr308残基的磷酸化水平，并在较高浓度下降低总AKT表达。定量密度分析证实，与未处理对照细胞相比，BR 56 Hex F处理后PI3K/AKT通路激活逐渐受抑。鉴于PI3K/AKT信号在调节CRC细胞增殖、存活、代谢和凋亡抵抗中的关键作用，观察到的PI3K/AKT磷酸化抑制提示BR 56 Hex F至少部分通过抑制该致癌通路发挥抗癌作用。这些发现表明BR 56 Hex F可能干扰PI3K/AKT介导的存活信号，从而抑制HT-29 CRC细胞生长。
3.6. BR 56番木瓜（C. papaya L.）口服给药对AOM/DSS处理ICR小鼠的影响
小鼠接受AOM/DSS诱导结直肠癌发生方案，并在整个实验期间经口给予BR 56番木瓜提取物，以评估番木瓜提取物对CRC的化学预防作用。每周监测体重以评估治疗期间动物总体健康状况。与阴性对照组（NC）相比，AOM/DSS对照（Con）组小鼠在DSS给药后表现初始体重下降。然而，体重在实验后期逐渐恢复。整个研究期间，经口接受BR 56提取物的小鼠体重与AOM/DSS对照动物相当，无明显治疗相关不良效应。5-氟尿嘧啶（5-FU）组也未显示统计学显著的体重降低，提示两种治疗在实验条件下耐受良好。结肠缩短是AOM/DSS诱导CRC模型中结肠炎相关结肠癌的常见特征。与NC组（134.5 ± 1.0 mm）相比，对照组结肠长度显著缩短（101.5 ± 1.9 mm）。相反，BR 56番木瓜（C. papaya L.）提取物处理显著减轻AOM/DSS诱导的结肠缩短，使平均结肠长度增至115.8 ± 7.8 mm（相较于AOM/DSS对照组的101.5 ± 1.9 mm，p < 0.05）。5-FU处理组显示相当的平均结肠长度114.3 ± 8.5 mm，显著大于AOM/DSS对照组（p < 0.05）。此外，AOM/DSS对照组肿瘤数量显著高于NC组，而口服BR 56提取物相较于AOM/DSS对照组显著减少肿瘤数量。5-FU处理组观察到类似的肿瘤数量减少。定量分析显示，CRC对照组每只小鼠平均发生9.00 ± 1.22个肿瘤，而BR 56和5-FU处理组分别发生4.20 ± 0.45和5.20 ± 0.45个肿瘤。这些发现表明BR 56提取物抑制AOM/DSS诱导的结肠肿瘤发展。脾肿大是AOM/DSS诱导结直肠癌发生相关全身炎症的标志。AOM/DSS对照组相对脾重显著高于阴性对照组，表明全身炎症反应增强。与AOM/DSS对照组相比，BR 56番木瓜提取物处理显著降低相对脾重。5-FU处理组观察到类似降低。这些发现提示BR 56番木瓜提取物减轻AOM/DSS诱导的全身炎症。使用苏木精和伊红（H&E）染色对结肠组织进行组织学分析，进一步证明BR 56处理的保护作用。NC组显示完整黏膜结构和组织良好的结肠隐窝，而AOM/DSS对照组显示大量炎性细胞浸润、黏膜损伤和隐窝破坏。BR 56处理显著减轻这些病理改变，结肠结构保存改善。5-FU处理组观察到类似组织学改善。与这些形态学观察一致，炎症评分从阴性对照组的0.28 ± 0.22增至AOM/DSS给药后的1.66 ± 0.29。BR 56处理使炎症评分降至1.13 ± 0.30，而5-FU处理组显示相当评分1.15 ± 0.15。AOM/DSS对照组炎症范围和隐窝损伤评分也显著增加，而BR 56处理后两参数均显著降低。检测结肠组织中PI3K（p85）和磷酸化AKT（p-AKT；Ser473）蛋白表达水平，以确定BR 56番木瓜（C. papaya L.）果实提取物是否通过调控PI3K/AKT信号通路减轻结肠炎相关结直肠癌（CAC）。AOM/DSS处理较阴性对照组增加PI3K（p85）和p-AKT（Ser473）表达。与AOM/DSS对照组相比，BR 56番木瓜（C. papaya L.）提取物处理降低PI3K（p85）和p-AKT（Ser473）表达。类似地，阳性对照5-氟尿嘧啶处理也降低PI3K/AKT信号通路激活。
讨论部分：CRC是全球健康关切，需要开发能有效抑制肿瘤生长同时尽量减少治疗相关毒性的有效治疗药物。从药用和食用植物获得的天然化合物因其含有结构多样的生物活性化合物及多种生物活性而作为抗癌药物的有前景来源受到关注。本研究探究了来自韩国济州栽培的BR 56番木瓜（C. papaya L.）果实己烷组分的抗癌潜力及潜在分子机制，该组分在体外和体内均显示出对CRC的强效抗癌活性。研究人员的发现表明，BR 56 Hex F通过执行双重分子机制驱动CRC细胞凋亡：抑制致癌PI3K/AKT轴，同时矛盾性地诱导晚期自噬流阻断。
既往评估番木瓜（C. papaya L.）抗癌潜力的研究已确立其对多种人类恶性肿瘤（包括乳腺癌、前列腺癌、肝癌和结直肠癌）的广泛化学预防和抗肿瘤能力。在CRC模型中，埃及栽培番木瓜（C. papaya L.）的粗水提物和醇提种子提取物已被证明通过p53激活、细胞色素释放和cleaved caspase 3激活触发G2/M期细胞周期阻滞和内在凋亡，并下调抗凋亡Bcl-2家族成员。类似地，印度栽培番木瓜（C. papaya L.）的叶和果肉提取物据报通过调控Wnt/β-catenin信号和凋亡通路抑制结肠癌细胞增殖和迁移。另一项研究中，印度栽培成熟番木瓜（C. papaya L.）的甲醇提取物对HT-29细胞显示生长抑制作用，伴随ROS水平增加、细胞迁移减少和克隆形成能力降低。然而，现有番木瓜（C. papaya L.）癌症研究文献主要集中于热带品种的粗极性提取物。
不同地理区域栽培番木瓜（C. papaya L.）的植物化学研究也证明其植物化学成分在植物部位和品种间存在变异。一项关于印度尼西亚番木瓜的研究报道了不同极性溶剂制备的果肉、果皮和种子提取物在总酚和总黄酮含量上的差异。此外，一项关于泰国栽培红肉和黄肉番木瓜品种的研究鉴定了多种酚类化合物，包括咖啡酸、没食子酸、阿魏酸、儿茶素、没食子儿茶素、槲皮素衍生物和山奈酚衍生物。这些酚类化合物在不同极性溶剂制备的果皮、果肉和种子提取物中的分布各异。另一项关于印度栽培番木瓜（C. papaya L.）的研究使用LC–MS/MS在番木瓜水提物中鉴定了5-羟基阿魏酰奎宁酸、丁香酸己糖苷、乙酰对香豆酰奎宁酸、槲皮素-3-O-鼠李糖苷、5-羟基咖啡酰奎宁酸、芍药花素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、芥子酸-O-己糖苷和甲基阿魏酰糖苷。与既往主要研究热带品种粗极性提取物的番木瓜（C. papaya L.）研究不同，本研究聚焦于韩国栽培未成熟BR 56果实制备的非极性己烷组分（BR 56 Hex F）。与既往番木瓜提取物诱导ROS产生和凋亡的报道一致，本研究也证明ROS产生增加和凋亡诱导。然而，番木瓜（C. papaya L.）提取物在自噬调控和PI3K/AKT等致癌信号通路中的参与仍研究不足。这些比较为研究人员的发现提供背景，但并未确立更强效力或品种特异性效应，因为研究在植物材料、提取方法和实验条件上存在差异。
PI3K/AKT通路在约60%癌症病例中激活，是细胞增殖、代谢适应和化疗耐药的主要调节因子。该信号级联的药理学抑制常触发自噬等适应性生存机制。通常，上游PI3K/AKT/mTOR信号抑制解除对ULK1的抑制性限制，启动早期自噬核化以回收营养并保护细胞器完整性。与该情景一致，研究人员发现BR 56 Hex F给药显著下调PI3K催化（p110）和调节（p85）亚基，降低AKT下游磷酸化（Ser473/Thr308），并抑制mTOR活性。这些发现表明BR 56 Hex F破坏CRC细胞中PI3K/AKT/mTOR存活轴。尽管PI3K/AKT/mTOR信号受抑，BR 56 Hex F并未表现有效的自噬降解。相反，多项观察提示自噬流在晚期受损。
既往研究证据提示，PI3K依赖性存活通路的药理学抑制可能促进结直肠癌细胞凋亡。在机制上，AKT通过抑制内在线粒体凋亡信号并激活促凋亡蛋白Bax和Bak促进细胞存活。因此，抑制PI3K/AKT信号可能削弱这些促存活机制，促进线粒体外膜通透化、细胞色素c释放及随后的caspase激活。这些机制为研究人员研究中PI3K/AKT抑制与凋亡之间可能联系提供生物学依据。然而，研究人员未直接评估Bax/Bak激活或细胞色素c释放。与该解释一致，BR 56 Hex F处理增加cleaved caspase-9和cleaved caspase-7水平，提示内在凋亡信号的参与。总体而言，这些发现提示抑制PI3K/AKT/mTOR介导的存活信号可能参与BR 56 Hex F诱导的凋亡，尽管信号和凋亡标志物的同步变化并未确立因果关系。需要进一步机制研究确定PI3K/AKT抑制是否为凋亡反应所必需。
LC3-II与自噬体膜相关，常用于评估自噬体丰度。然而，单独LC3-II水平增加不能区分自噬体形成增强与自噬体降解受损。因此，研究人员检测p62/SQSTM1作为自噬降解的额外标志物。p62/SQSTM1作为选择性自噬货物受体，结合泛素化蛋白并促进其递送至自噬体进行后续溶酶体降解。正常自噬条件下，p62通过自噬–溶酶体通路降解；因此，其蓄积可能提示自噬降解受损。在本研究中，BR 56 Hex F处理呈浓度依赖性增加LC3-II和p62/SQSTM1水平，提示自噬体蓄积伴随自噬降解减少。这些发现引导研究人员研究溶酶体功能障碍是否促成观察到的晚期自噬流受损。为进一步探究溶酶体在该过程中的潜在参与，研究人员检测溶酶体相关膜蛋白1（LAMP1），一种与溶酶体完整性和功能相关的主要溶酶体膜蛋白。BR 56 Hex F处理降低LAMP1蛋白表达，提示溶酶体丰度或稳态改变，尽管该测量本身不能确立溶酶体功能障碍。为进一步评估自噬流，研究人员进行串联荧光mRFP–EGFP–LC3报告基因分析。BR 56 Hex F处理细胞显示黄色斑点丰度增加，伴随仅红色斑点相对减少，表明非酸化自噬区室蓄积及向酸性自噬溶酶体区室推进减少。在氯喹处理细胞中观察到类似模式，支持BR 56 Hex F损害晚期自噬加工的可能性。
综上所述，这些发现提示BR 56 Hex F抑制PI3K/AKT/mTOR信号，同时破坏自噬的下游完成，导致晚期自噬阻断。类似发现已在化疗耐药卵巢癌细胞中报道，4-乙酰基安曲醌醇B抑制PI3K/AKT/mTOR/p70S6K通路伴随自噬流抑制和癌细胞死亡增强。抗菌肽WK-13-3D也据报抑制AKT/mTOR信号，同时引起LC3 II蓄积和p62稳定，并损害自噬体向自噬溶酶体进展。这些发现进一步表明AKT/mTOR信号通路抑制可与癌细胞自噬流破坏同时发生。在BR 56 Hex F处理的HCT-116细胞中也观察到类似自噬相关蛋白变化，包括mTOR表达降低及LC3-II和p62水平增加。这些变化在两种CRC细胞模型中的一致性支持观察到的反应的可重复性，并表明BR 56 Hex F可能干扰自噬降解而非产生细胞系特异性效应。BR 56 Hex F调控PI3K/AKT抑制、损害自噬并促进线粒体凋亡。此外，BR 56 Hex F促进ROS产生和线粒体ROS蓄积。BR 56 Hex F处理细胞中升高的ROS水平可能来源多样，包括线粒体功能障碍及自噬抑制后未降解蛋白聚集体蓄积相关的蛋白毒性应激。这些过程可能共同加剧细胞内氧化应激。研究人员的进一步发现显示BR 56 Hex F处理后cleaved caspase-9和cleaved caspase-7激活增加，而尽管存在总caspase-3，未检测到cleaved caspase-3。Cleaved caspase-9是内在线粒体凋亡通路的关键启动子，随后激活执行caspase，包括cleaved caspase-3和cleaved caspase-7。本研究中观察到的cleaved caspase-7激活可能与BR 56 Hex F诱导的线粒体凋亡信号相关。然而，所检测条件下无可检测cleaved caspase-3并不排除其参与。遗传和分子背景可影响CRC细胞凋亡反应。尽管如此，所检测条件下无可检测cleaved caspase-3并不一定排除其在凋亡反应中的参与。HT-29细胞据报表现出caspase-3表达或活性缺陷，这可能影响其凋亡反应并有利于caspase-7介导的细胞死亡执行。因此，观察到的caspase剪切模式可能部分反映HT-29细胞的内在分子特征，而非BR 56 Hex F特异性替代凋亡机制。然而，本研究未直接探究该可能性。
研究人员随后在AOM/DSS诱导结肠炎相关CRC小鼠模型中评估BR 56番木瓜（C. papaya L.）提取物的体内化学预防效力。体内和体外实验分别使用不同制剂，即BR 56 Hex F和BR 56番木瓜（C. papaya L.）提取物。因此，动物发现不能直接确立己烷组分的体内效力或机制。口服BR 56提取物显著减轻结肠缩短并降低相对脾重（脾肿大）至与标准化疗药5-FU相当的水平，且不诱导全身毒性或对体重的不良效应。组织学分析提供组织保护的额外证据，BR 56处理减少炎性细胞浸润、黏膜损伤、隐窝破坏和组织学评分。这些效应与5-FU处理组观察到的效应一致。PI3K/AKT信号通路在CRC中常失调，并参与肿瘤细胞存活、增殖和凋亡抵抗。因此，靶向该通路已被研究作为CRC预防和治疗的潜在策略。此外，BR 56处理降低结肠组织中PI3K p85和磷酸化AKT（Ser473）表达，支持PI3K/AKT信号降低与观察到的体内效应之间的关联。既往使用AOM/DSS诱导CRC模型的研究同样报道PI3K/AKT信号抑制与肿瘤发展减少及炎症相关通路调控相关。例如，茶褐素（TB）处理据报抑制PI3K/AKT/mTOR信号并减少结直肠肿瘤负荷。此外，另一项研究中，汉黄芩苷通过调控PI3K/AKT介导的NF-κB激活减轻炎症相关结直肠癌发生。这些发现与研究人员体内观察一致，提示PI3K/AKT通路调控可能参与BR 56番木瓜（C. papaya L.）提取物在结肠炎相关CRC中的化学预防效应。由于BR 56给药始于AOM注射日，这些结果主要支持其在结直肠癌发生过程中的预防潜力，而非证明对已建立肿瘤的疗效。
据研究人员所知，本研究首次提供证据表明从济州栽培未成熟BR 56番木瓜（C. papaya L.）获得的己烷组分对结直肠癌表现出抗癌活性。体外，该活性通过PI3K/AKT/mTOR抑制、晚期自噬流受损和线粒体凋亡诱导介导。在动物模型中，给予BR 56番木瓜（C. papaya L.）提取物减轻AOM/DSS诱导的炎症和组织损伤，伴随结肠组织中PI3K（p85）和磷酸化AKT水平降低。然而，这些发现并未确立体内自噬流受损或线粒体凋亡。这些发现为本地栽培番木瓜（C. papaya L.）的抗癌潜力提供新机制见解，并支持进一步研究BR 56 Hex F作为潜在天然化学预防候选物。
本研究存在若干局限性。首先，BR 56 Hex F是多种生物活性化合物的复杂混合物。因此，需要进一步生物活性导向分离和结构表征以鉴定活性成分并阐明其单独或联合对观察到的抗癌活性的贡献。其次，研究人员未探究BR 56 Hex F与临床使用化疗药（如5-氟尿嘧啶或奥沙利铂）的潜在协同效应。需要进一步研究确定BR 56 Hex F是否能增强这些药物在CRC中的疗效。最后，尽管体内研究证明BR 56提取物在AOM/DSS诱导CRC模型中的抗癌效应，但未进行全面的毒性和药代动力学评估。需要进一步使用BR 56 Hex F的体内研究评估其安全性、药代动力学特性和治疗潜力。
结论部分翻译：本研究提供全面的分子和体内框架，证明济州栽培番木瓜（C. papaya L.）（BR 56）己烷组分对CRC的强效抗肿瘤活性。通过同时沉默致癌PI3K/AKT/mTOR存活轴并破坏晚期自噬流，BR 56 Hex F将适应性细胞回收过程转化为不可解决的细胞器应激、蛋白毒性和ROS蓄积状态。这种细胞器和氧化危机驱动CRC细胞走向caspase-9/caspase-7介导的内在凋亡通路。此外，BR 56提取物在体内有效抑制结肠炎相关结直肠癌发生并减轻全身炎症，无任何可观察毒性。总体而言，这些发现凸显本地栽培番木瓜（C. papaya L.）亲脂性组分作为结直肠恶性肿瘤新型天然化学预防候选物或辅助治疗剂的治疗潜力。
