CT衍生L3骨骼肌指数、握力与营养行为作为老年肿瘤住院患者衰弱互补维度：一项横断面观察性研究

《Nutrients》：CT-Derived L3 Skeletal Muscle Index, Handgrip Strength, and Nutritional Behavior as Complementary Dimensions of Frailty in Older Oncology Inpatients: A Cross-Sectional Observational Study

　　

背景/目的：代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）是一种常见的代谢性肝病，全球患病率不断上升。越来越多的证据表明，短链脂肪酸（SCFAs）在MASLD中发挥重要作用。中链脂肪酸（MCFAs）虽研究较少，亦可能参与MASLD的发病机制。本研究旨在评估血浆SCFAs与MCFAs谱在MASLD组织学谱系中的分布及其与疾病严重程度临床、生化和组织病理学特征的关联。方法：纳入115例接受减重手术的肥胖成人。术中肝活检采用脂肪变、活动度、纤维化（SAF）评分评估。受试者分为无MASLD组（n=26）、代谢功能障碍相关脂肪性肝（MASL）组（n=42）和代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）组（n=47）。采用液相色谱-质谱联用（LC-MS）定量血浆中6种SCFAs和2种MCFAs。结果：MASH患者较无MASLD者血浆乙酸盐水平更低、己酸盐水平更高。乙酸盐与ALT、AST、GGT、葡萄糖、HbA1c、细胞角蛋白-18、SAF评分、脂肪变及小叶内炎症呈负相关，而己酸盐与SAF评分及小叶内炎症呈正相关。较高的乙酸盐浓度与较低的MASH患病风险独立相关（OR 0.973；p=0.040），而ALT水平与MASH风险增加独立相关（OR 1.083，p=0.001）。结论：肥胖人群MASH以独特的循环脂肪酸谱为特征，即乙酸盐降低、己酸盐升高。较低的乙酸盐水平与MASH及代谢和组织学疾病严重程度标志物独立相关。

代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）目前影响约38%的成人及7–14%的儿童和青少年，据预测到2040年超过55%的成人可能受该病影响。MASLD的诊断依据为存在肝脂肪变证据并伴至少一项代谢危险因素，且无脂肪变的继发原因。在MASLD的病理生理过程中，共存的代谢性疾病如2型糖尿病（T2DM）可加速疾病进展。重要的是，部分MASLD患者可进展为代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH），部分病例进而发展为进展性纤维化、肝硬化和肝细胞癌。MASLD的发病过程涉及持续性营养过剩、脂肪组织功能障碍及胰岛素抵抗的发生。这些改变促进肝脏脂肪生成和脂毒性中间产物蓄积，触发肝内细胞应激反应。同时，肠道菌群组成和免疫稳态的紊乱进一步加重肝损伤。越来越多的证据表明，肠道菌群失调通过改变微生物代谢产物如短链脂肪酸（SCFAs）、胆汁酸、氨基酸衍生代谢物和乙醇的产生而参与MASLD。然而，肠道菌群失调与MASLD发病机制之间的确切机制仍不完全清楚。SCFAs主要包括乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐，是主要由膳食纤维经肠道发酵产生的微生物代谢产物。据报道，它们对MASLD发挥有益作用，部分通过激活AMP活化蛋白激酶（AMPK）这一肝脏代谢的核心调节因子实现。该激活增强胰岛素敏感性、抑制糖异生并限制脂肪生成。在胰腺内，SCFAs能够刺激胰岛素释放、支持β细胞增殖并减轻炎症反应，从而有助于预防T2DM。在脂肪组织中，它们减轻炎症并通过增强脂解和β氧化促进脂肪量减少，最终有助于肥胖管理。此外，SCFAs还与肠道L细胞产生肽YY和胰高血糖素样肽1（GLP-1）相关，后者可能影响饱腹感和能量摄入。另一方面，中链脂肪酸（MCFAs）为一般含6至12个碳原子的饱和脂肪酸，其吸收和肝脏代谢与长链脂肪酸不同。膳食MCFAs直接吸收入门静脉循环并迅速转运至肝脏，在那里进行线粒体β氧化，无需肉碱棕榈酰转移酶系统作为长链脂肪酸线粒体氧化的限速步骤。除作为能量底物外，越来越多证据提示MCFAs还可作为信号分子影响参与肝脏脂质代谢的代谢和炎症通路。特别是某些MCFAs可激活G蛋白偶联受体84（GPR84），这是一种主要表达于免疫细胞的游离脂肪酸受体，从而将MCFA信号与炎症反应联系起来。尽管调节GPR84已被提出作为MASH的潜在治疗策略，但内源性循环MCFAs在人类MASLD中的作用仍鲜有表征。尽管越来越多证据表明SCFAs参与与MASLD相关的代谢和炎症通路，但迄今大多数研究在实验模型中进行且结果不一致，而来自人类研究的证据仍然有限。此外，关于MCFAs及其在MASLD中的潜在参与所知更少。重要的是，循环SCFAs和MCFAs水平在肥胖个体MASLD组织学谱系中是否存在差异并与疾病严重程度相关仍不清楚。因此，本研究旨在表征经活检证实的MASLD肥胖个体循环SCFAs和MCFAs水平，并探讨其与疾病严重程度临床、生化和组织病理学特征的关联。

材料与方法部分：本研究纳入2020年1月至2022年10月在西班牙穆尔西亚Virgen de la Arrixaca大学医院接受减重手术的123例连续肥胖成人。纳入标准为年龄18–65岁，体重指数（BMI）≥40 kg/m²，或BMI≥35 kg/m²且伴有临床相关肥胖相关合并症（T2DM、未控制高血压或阻塞性睡眠呼吸暂停综合征），并有至少5年肥胖史记录。排除标准为MASLD以外的任何病因慢性肝病、过量饮酒（男性>30 g/d或女性>20 g/d）、当前使用致脂肪变药物或GLP-1受体激动剂，或拒绝提供知情同意。初始评估123例中，5例因使用GLP-1激动剂、3例因过量饮酒被排除，最终研究人群为115例。缺失数据未进行插补。所有参与者均在减重手术中接受术中肝活检，依据肝组织学分为三组：无MASLD组；MASL组，定义为存在≥5%肝脂肪变（1级或以上）并伴肝细胞气球样变或小叶内炎症之一（但不同时具备两者）；MASH组，特征为脂肪变1级或以上并同时伴气球样变和小叶内炎症，伴或不伴纤维化。本研究遵循《赫尔辛基宣言》和当地法规，获Virgen de la Arrixaca大学医院伦理与临床研究委员会批准（批准号2020-2-4-HCUVA，2020年3月31日），所有参与者入组前均提供书面知情同意。临床与生化参数方面，参与者完成结构化术前临床评估，收集年龄、病史、现患疾病及相关治疗，并记录体重、身高和腰围等人体测量参数，BMI按Quetelet公式计算。体成分采用50 kHz生物电阻抗分析仪（Tanita MC-980MA-N plus）按制造商说明评估。术前生化数据于减重手术当日至少空腹12 h后采集，血样离心后血清用于后续分析，标准实验室检测包括空腹血糖、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDLc）、甘油三酯（TG）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、γ-谷氨酰转移酶（GGT）、载脂蛋白A-I（Apo-AI）和载脂蛋白B（Apo-B），均使用Cobas c702分析仪按标准化方案测定；低密度脂蛋白胆固醇（LDLc）采用Friedewald公式估算；糖化血红蛋白（HbA1c）采用Tosoh HLC-723G8糖化血红蛋白分析仪定量；血清胰岛素采用Cobas e801分析仪测定；胰岛素抵抗采用胰岛素抵抗稳态模型评估（HOMA-IR）计算。细胞角蛋白-18（CK-18）M30水平采用M30 Apoptosense? ELISA试剂盒按制造商说明测定，450 nm处吸光度用Spectrostar Nano酶标仪测定，CK-18 M30水平（U/L）依据相应标准曲线计算。肝活检采集与样本处理方面，减重手术中采集至少1 cm²肝组织样本，肝活检组织经4%中性缓冲福尔马林（pH 7.4）固定并石蜡包埋，组织学分析在5 μm石蜡切片上进行，行苏木精-伊红、Masson三色、过碘酸-雪夫、普鲁士蓝和网状纤维染色。所有活检标本由Virgen de la Arrixaca大学医院和穆尔西亚生物医学研究所实验病理单元的资深肝脏病理学家依据脂肪变、活动度、纤维化（SAF）评分系统独立审阅和评分，病理学家对参与者的临床、生化和代谢组学数据设盲。血浆SCFAs和MCFAs的LC-MS分析方面，采用液相色谱-质谱联用（LC-MS）定量血浆中6种SCFAs和2种MCFAs，SCFAs为乙酸盐（C2:0）、丙酸盐（C3:0）、丁酸盐（C4:0）、异丁酸盐（C4:0）、戊酸盐（C5:0）和异戊酸盐（C5:0），MCFAs为己酸盐（hexanoate；C6:0）和庚酸盐（C7:0），所有分析标准品购自Sigma-Aldrich。样本制备和LC-MS分析按既往描述进行：取100 μL血浆与100 μL甲醇混合沉淀蛋白，振荡1 min后于4 °C以14,000 rpm离心10 min，取100 μL上清液用30 μL 0.1 M O-苄基羟胺盐酸盐甲醇溶液和30 μL 0.25 M N-(3-二甲氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐甲醇溶液衍生化，25 °C孵育1 h，衍生化样本用二氯甲烷萃取后蒸发，残渣用250 μL甲醇-水复溶后进样。色谱分离采用Infinity II UHPLC系统配反相Poroshell C18 EC柱（100 × 2.1 mm，3 μm），柱温35 °C，进样量4 μL，流动相流速0.4 mL/min，使用溶剂A（0.2%甲酸水溶液）和溶剂B（0.2%甲酸甲醇溶液），梯度洗脱于0、3、8和15 min时分别为15%、15%、70%和98%溶剂B。检测采用Agilent Technologies 6470三重四极杆质谱仪配电喷雾电离（ESI）源正离子模式，源条件为毛细管电压3.0 kV、源温度200 °C、源气流10 L/min、雾化器压力20 psi、鞘气温度和流量分别为250 °C和10 L/min，碰撞能量在5–30 eV范围内优化。多反应监测（MRM）跃迁通过注射1 ppm各脂肪酸标准品溶液优化，以选择灵敏度和选择性最佳的跃迁。定量基于基质匹配校准，使用加标五个浓度（0.25、0.5、1、5和10 μM）标准混合物的血浆样本，该方法可评估分析过程中的基质效应和分析物回收率。统计分析方面，结果以中位数（四分位距）表示，研究变量的正态分布采用Kolmogorov–Smirnov检验评估，组间比较采用Kruskal–Wallis检验，随后以Mann–Whitney U检验进行事后两两分析，多重检验采用Bonferroni校正，显著性阈值设为p<0.0167（0.05/3次比较）。评估T2DM在已确诊MASLD参与者中影响的亚组分析中，排除无MASLD的T2DM参与者。分类变量采用卡方检验比较，连续变量间关联采用Spearman秩相关检验评估。首先进行单因素logistic回归分析以识别与MASH存在相关的人口学、人体测量学、临床和生化因素，多重共线性采用方差膨胀因子（VIF）和容差评估，性别、年龄及单因素logistic回归分析中p<0.10的变量被认为适合纳入多变量模型，采用基于Wald统计量的后向逐步变量选择程序，入选显著性标准为p<0.05、剔除标准为p>0.10。统计分析采用SPSS 28.0.1.1版完成，图表采用Prism 9.0版生成。

结果部分：研究人群特征方面，共纳入115例患者，其中23%（n=26）无MASLD、37%（n=42）为MASL、40%（n=47）为MASH。研究人群平均年龄47.3岁，平均BMI 42.9 kg/m²，各组均以女性为主。糖尿病前期和T2DM分别见于39%（n=45）和31%（n=36）的患者，且在肝病更进展的患者中患病率更高。相应地，MASL和MASH患者空腹血糖、HbA1c、胰岛素和HOMA-IR更高。血脂谱特征为MASLD患者甘油三酯和Apo-B水平升高、HDL-C和Apo-AI浓度降低。肝损伤标志物包括转氨酶和CK-18在MASL和MASH患者中亦升高。整合脂肪变、活动度（肝细胞气球样变和炎症）和纤维化的SAF评分在MASH患者中显著高于MASL患者，各组分分析显示脂肪变分级在组间差异显著，MASH患者分级更高。血浆SCFAs和MCFAs差异取决于MASLD存在与否方面，所测各物种中乙酸盐最丰富，其次为丙酸盐。与无MASLD个体相比，MASH患者血浆乙酸盐水平更低、己酸盐浓度更高，其余所分析SCFA和MCFA物种的血浆浓度在各研究组间未见显著差异。按MASLD和T2DM状态分层后，合并MASLD和T2DM的个体较无MASLD且无T2DM者血浆乙酸盐更低、己酸盐更高；然而在MASLD患者中，血浆SCFAs和MCFAs浓度不因T2DM状态而异。血浆SCFAs/MCFAs与MASLD相关组织病理学/生化参数的关联方面，相关性分析显示乙酸盐与ALT（r：?0.309；p<0.001）、CK-18（r：?0.320；p<0.001）、AST（r：?0.260；p=0.003）、GGT（r：?0.193；p=0.003）、葡萄糖（r：?0.228；p=0.009）、HbA1c（r：?0.212；p=0.009）、SAF评分（r：?0.248；p=0.004）、脂肪变（r：?0.212；p=0.015）和小叶内炎症（r：?0.261；p=0.003）呈负相关；相反，血浆己酸盐水平与SAF评分（r：0.184，p=0.036）和小叶内炎症（r：0.172，p=0.050）呈弱正相关。与MASH相关的因素方面，单因素logistic回归分析显示T2DM、HbA1c、HOMA-IR和ALT水平与MASH存在相关。随后构建简约多变量logistic回归模型，115例中排除15例因数据缺失者后100例纳入多变量分析，其中36例患MASH。研究发现较高的血浆乙酸盐浓度与较低的MASH患病风险相关（OR 0.973，95% CI 0.947–0.999，p=0.040），表明血浆乙酸盐每增加一个单位与MASH患病风险约降低2.7%相关；相反，ALT水平与MASH存在独立相关（OR 1.083，95% CI 1.035–1.133，p=0.001）；HOMA-IR经校正后与MASH无独立关联（OR 1.176；95% CI 0.979–1.412；p=0.083）。

讨论部分：本研究评估了肥胖患者不同MASLD阶段的血浆SCFA谱，发现与MASLD严重程度相关的独特血浆脂肪酸谱，特征为MASH患者乙酸盐降低和己酸盐升高，且这些改变仅见于MASH患者，提示循环脂肪酸代谢的改变可能与MASLD更进展和炎症表型特别相关；此外，多变量logistic回归分析确定较高血浆乙酸盐浓度与较低MASH患病风险独立相关，而较高ALT水平与MASH风险增加独立相关。本队列观察到的较低乙酸盐水平与Thing等的报道一致，其描述MASLD患者较健康个体血浆乙酸盐更低，以及丙酸盐、甲酸盐、戊酸盐和甲基丁酸盐升高并与更高纤维化程度相关；相反，Tsai等报道甲酸盐、异丁酸盐和甲基丁酸盐降低伴异戊酸盐升高，值得注意的是该研究所有参与者均患T2DM，而本队列仅31%患T2DM，此外本研究人群完全由肥胖个体组成并按MASLD存在及严重程度分层，研究设计差异可能部分解释研究间SCFA谱的差异。尽管本队列未观察到血浆丙酸盐水平随MASLD存在而异，但临床前研究报告补充该SCFA可使小鼠体重、血压、胰岛素水平、肝脂肪变和肝脏炎症降低，且丙酸盐与减重手术后更大体重减轻相关；本队列无显著差异可能反映研究人群、膳食摄入、肠道菌群组成、用药或伴随代谢状况的差异。丁酸盐是一种通过抑制组蛋白去乙酰化酶抑制免疫反应和减轻肝脏炎症的SCFA，既往研究报告MASL中升高、MASH中降低，而本队列仅观察到轻微下降趋势（p=0.059）；此外Xiong等观察到肝硬化患者丁酸盐水平显著降低，与既往报告MASLD患者与健康对照循环丁酸盐无显著差异的研究类似，本队列未观察到循环丁酸盐的显著变化，此差异可能反映研究设计、人群特征或代谢背景如本队列BMI升高（>40 kg/m²）的差异；重要的是，越来越多证据表明不同SCFAs中乙酸盐较丁酸盐和丙酸盐对减轻肝脂肪变的作用最显著。乙酸盐是循环中最丰富的SCFA，约占总SCFAs的60%，因而在血清中较丙酸盐和丁酸盐占优势。本研究特别观察到MASH患者血浆乙酸盐降低，多变量分析显示低乙酸盐水平与MASH存在及ALT升高独立相关。MASH患者乙酸盐水平显著低于无MASLD者，而MASL与无MASLD组间无显著差异；类似地，其他研究报告有与无MASLD者循环乙酸盐无差异，而肝硬化患者乙酸盐浓度较MASLD患者降低；疾病早期观察到的较高乙酸盐水平可能反映对炎症的代偿反应或MASLD进展中肠道菌群进行性改变继发后果。本研究中T2DM虽未显著改变MASLD患者乙酸盐水平，但血糖控制不佳与较低乙酸盐浓度相关，提示血糖控制可能影响循环乙酸盐水平，尽管潜在机制尚待确定；糖尿病小鼠模型的实验证据支持这一观点，补充乙酸盐较对照降低空腹血糖和HbA1c，这些效应至少部分由激活肝脏AMPK介导，AMPK是能量感应酶，在葡萄糖稳态中起关键作用，调节多条代谢通路包括葡萄糖转运体4（GLUT4）表达，同时增强脂肪酸氧化和减少脂肪生成；此外循环乙酸盐水平与ALT和AST水平呈负相关，与本结果显示乙酸盐浓度与这些肝酶负相关一致；既往临床前研究证明补充乙酸盐减少肝脏脂质蓄积并减轻促炎巨噬细胞活性和TNF-α表达；总之这些发现支持进一步研究乙酸盐代谢作为MASLD潜在治疗靶点，同时承认这些实验效应的临床相关性尚待确定。关于己酸盐，其循环水平一般较低，虽在MASH患者中观察到升高，且己酸盐水平与SAF评分相关，但未发现与其他生化或组织病理学变量的显著相关，这可能由其低浓度和有限样本量解释；与本研究一致，一项使用HepG2细胞的体外研究报告己酸较长链脂肪酸不促进肝脏脂质蓄积或胰岛素抵抗发生；此外一项临床前研究中，以占总膳食重量2.5%的己酸盐补充12周对肝脂肪变或炎症未见显著影响；总之这些数据提示与乙酸盐不同，循环己酸盐与MASLD的关联可能较弱，其潜在病理生理相关性仍不清楚。本研究存在一定局限性：第一，相对较小的样本量可能限制检测较弱关联的统计效能，尤其是对低循环浓度代谢物；第二，分析的横断面设计无法确立循环SCFAs/MCFAs与MASLD严重程度间的因果关系；第三，队列以女性为主且由接受减重手术的重度肥胖个体组成，可能限制研究结果对其他人群的推广；此外队列中纤维化代表性有限，这一局限性可能限制研究结果在MASLD全严重程度谱中的推广；尽管队列可能与本研究组既往报道的人群有重叠，但本研究通过专门研究短链和中链脂肪酸与MASLD组织学特征的关联而探讨了不同的研究问题；最后，多变量logistic回归结果应谨慎解读，因样本量和采用后向变量选择可能导致过拟合。尽管存在这些局限性，本研究亦有若干显著优势，包括采用肝活检进行MASLD组织学表征和分期，以及使用LC-MS直接定量血浆SCFAs和MCFAs；此外同时评估多种SCFAs可全面评价其与疾病严重程度的差异性关联。

结论部分译文：总之，与无MASLD患者相比，MASH患者血浆乙酸盐降低、己酸盐升高。血浆乙酸盐水平与MASH独立相关，并与肝细胞损伤和血糖控制标志物呈负相关。这些发现支持循环乙酸盐与MASLD严重程度之间存在潜在关联，并值得进一步研究该关系的潜在机制及其治疗意义。