雪莲糖基转移酶SiUGT03与SiRhaT68-1催化芦丁生物合成的功能鉴定

《International Journal of Molecular Sciences》：Functional Characterization of Glycosyltransferases from Saussurea involucrata Involved in Rutin Biosynthesis

　　

摘要：雪莲（Saussurea involucrata）是一种富含黄酮类化合物的药用植物，但负责该物种黄酮糖基化的糖基转移酶（glycosyltransferases, GTs）在很大程度上仍未得到表征。本研究鉴定出五个GT基因（SiUGT03、SiUGT09、SiUGT60、SiRhaT68-1和SiRhaT68-2）。其中四个蛋白（SiUGT03、SiUGT09、SiUGT60和SiRhaT68-1）拥有完整的PSPG-box，系统发育分析将SiUGT03归入3GT分支，将SiRhaT68-1归入1,6GT分支。重组蛋白在大肠杆菌（Escherichia coli）中以可溶性麦芽糖结合蛋白（maltose-binding protein, MBP）融合形式表达并纯化。体外酶活测定显示，SiUGT03催化槲皮素的3-O-葡萄糖基化生成异槲皮苷（quercetin-3-O-glucoside），而SiRhaT68-1催化异槲皮苷的1,6-鼠李糖基化生成芦丁。在所测试的底物中，SiUGT03仅对黄酮醇类槲皮素和山奈酚有活性，而SiRhaT68-1对异槲皮苷和四种测试的黄酮7-O-葡萄糖苷中的一种——香叶木素-7-O-葡萄糖苷有活性。动力学分析显示，在测试条件下两种酶的表观催化效率存在明显差异（SiUGT03：Km = 36.08 μM，kcat/Km = 0.01983 μM?1·s?1；SiRhaT68-1：Km = 184.70 μM，kcat/Km = 0.0005755 μM?1·s?1）；然而，由于SiRhaT68-1的Km接近所测试的最高底物浓度，这一差异应视为初步结果。这些从独立体外实验中得出的结果表明，这两种酶催化了芦丁生物合成中两个连续的末端糖基化步骤，并代表了进一步探索雪莲中芦丁生物合成的有前景的候选酶。

雪莲糖基转移酶催化芦丁生物合成的功能鉴定：研究解读

一、研究背景与科学问题

雪莲（Saussurea involucrata）是原产于中国新疆高海拔地区的珍稀药用植物，因其抗炎、抗氧化和免疫调节活性而在传统医学中广泛应用。这些活性主要归因于其丰富的黄酮类化合物，包括芦丁、槲皮素和山奈酚衍生物。黄酮类化合物的糖基化是一种关键的结构修饰，能够增强这些化合物的溶解性、稳定性和生物活性，该过程由尿苷二磷酸糖基转移酶（UDP-glycosyltransferases, UGTs）催化，它们将糖基从UDP-糖供体转移到受体分子上。尽管雪莲的化学成分已被广泛研究，但负责其特征性黄酮糖苷（尤其是芦丁）形成的酶在很大程度上仍未被鉴定。植物UGT构成一个庞大的多基因家族，其特点是保守的C端PSPG-box（植物次生代谢产物糖基转移酶盒）用于结合UDP-糖供体，以及决定受体特异性的可变N端结构域。根据区域选择性和糖供体特异性，参与黄酮生物合成的UGT被分为多个亚家族，包括3GT、5GT、7GT、1,2GT和1,6GT。其中，3-O-葡萄糖基转移酶（3GTs）和1,6-鼠李糖基转移酶（1,6RhaTs）催化芦丁生物合成的两个连续步骤：槲皮素的3-O-葡萄糖基化生成异槲皮苷，以及随后异槲皮苷的1,6-鼠李糖基化生成芦丁。在荞麦、柑橘属和槐树等多种植物中，催化这两步反应的UGT已被功能鉴定，并显示出不同的底物偏好和催化特性。然而，雪莲中负责芦丁生物合成的UGT此前尚未被鉴定。因此，本研究旨在填补这一空白，通过基因克隆、重组蛋白表达、体外酶活测定、酶动力学和系统发育分析，鉴定并功能表征雪莲中参与黄酮糖基化的潜在UGT基因。

二、研究方法概述

研究人员从雪莲组培苗全株组织提取总RNA并进行转录组测序（三个生物学重复），通过BLASTP搜索鉴定出五个候选糖基转移酶基因。采用同源臂引物将目标基因插入pMAL-c5X载体，转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞进行诱导表达，并通过直链淀粉树脂亲和层析柱纯化获得麦芽糖结合蛋白（MBP）融合蛋白。体外酶活反应以UDP-葡萄糖和UDP-鼠李糖为糖供体，分别以多种黄酮类化合物为底物，利用超高效液相色谱（UPLC）和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）检测产物生成。酶动力学分析采用米氏方程拟合，计算动力学参数。

三、研究结果

2.1 芦丁推定的生物合成途径预测与系统发育分析

研究人员提出了雪莲中芦丁的推定生物合成途径，从苯丙氨酸经苯丙烷代谢途径上游步骤逐步转化为槲皮素，最后由UGT和鼠李糖基转移酶（RhaTs）催化两步末端糖基化反应生成芦丁。

2.2 多序列比对与系统发育分析

氨基酸序列比对显示，SiUGT03、SiUGT09、SiUGT60和SiRhaT68-1四个蛋白含有完整的PSPG-box和保守的HCGWNS基序，而SiRhaT68-2缺失大部分PSPG-box区域。系统发育树分析将SiUGT03归入3GT分支，与柑橘和葡萄的特征化3-O-糖基转移酶聚为一类；将SiRhaT68-1归入1,6GT分支，与参与芦丁生物合成的特征化1,6-鼠李糖基转移酶（Cs1,6RhaT、Cm1,6RhaT和Fe1,6RhaT）聚为一类。SiUGT60和SiUGT09分别被分配到5GT和1,2GT分支。

2.3 蛋白表达与纯化

SDS-PAGE分析显示，纯化的MBP融合SiGT蛋白条带位于约82–96 kDa，与理论分子量一致，蛋白浓度超过1.8 mg/mL。

2.4 体外酶促反应

以UDP-葡萄糖为糖供体、槲皮素为底物的反应中，只有SiUGT03产生产物峰，保留时间与异槲皮苷标准品一致，LC-MS/MS确认准分子离子峰为m/z 463.09 [M ? H]^?，证明SiUGT03催化槲皮素的3-O-葡萄糖基化生成异槲皮苷。以UDP-鼠李糖为糖供体、异槲皮苷为底物的反应中，只有SiRhaT68-1产生产物峰，保留时间与芦丁标准品一致，LC-MS/MS确认准分子离子峰为m/z 609.14 [M ? H]^?，证明SiRhaT68-1催化异槲皮苷的1,6-鼠李糖基化生成芦丁。

2.5 底物混杂性

在九种黄酮类底物中，SiUGT03仅对槲皮素和山奈酚有活性，对其他八种化合物无活性。在四种黄酮7-O-葡萄糖苷中，SiRhaT68-1仅对异槲皮苷和香叶木素-7-O-葡萄糖苷有活性，表明这两个酶的底物范围较窄。

2.6 SiUGT03和SiRhaT68-1的酶动力学

动力学曲线均符合米氏方程（R2 > 0.995）。SiUGT03的K_m为36.08 μM（95%置信区间：31.00–42.01），k_cat/K_m为0.01983 μM^?1·s^?1，表明其对槲皮素具有高亲和力和较高的催化效率。SiRhaT68-1的K_m为184.7 μM（95%置信区间：132.9–269.4），约为SiUGT03的五倍，k_cat/K_m为0.0005755 μM^?1·s^?1，表观催化效率低于SiUGT03。但由于SiRhaT68-1的K_m接近最高测试底物浓度，该差异应谨慎解释。

四、讨论与结论

讨论部分指出，本研究的核心发现是SiUGT03和SiRhaT68-1分别催化槲皮素的3-O-葡萄糖基化和异槲皮苷的1,6-鼠李糖基化，代表芦丁生物合成中两个独立的连续反应。这种催化角色分工与荞麦、柑橘和桃等植物中的模式相似，表明芦丁型黄酮糖苷的形成可能依赖不同植物谱系间相对保守的酶学策略。然而，所有证据均来自重组酶的体外实验，尚不能确定这两个酶在植物体内是否以这种顺序方式发挥作用。关于动力学差异，研究人员提出这可能反映了两个生物合成步骤之间的通量控制分工假设，但需进一步验证。从代谢工程角度看，鼠李糖基化步骤可能在异源宿主重建芦丁途径时需要特别关注。系统发育分析与体外酶活结果总体一致，增强了功能分配的可信度。本研究也存在若干方法学局限性，包括底物筛选范围有限、使用MBP融合蛋白可能影响活性、未检测基因在不同组织中的表达水平、以及动力学参数可能偏离体内真实环境。尽管如此，本研究提供了几个可验证的研究方向，SiUGT03和SiRhaT68-1可作为进一步植物体内功能验证、异源途径组装和结构功能研究的候选基因。

结论部分：本研究从雪莲中鉴定了五个糖基转移酶基因，其中两个在体外进行了功能表征。SiUGT03催化槲皮素的3-O-葡萄糖基化生成异槲皮苷，而SiRhaT68-1催化异槲皮苷的1,6-鼠李糖基化生成芦丁。动力学分析显示，在测试条件下两种酶的表观催化效率存在明显差异；然而，由于异槲皮苷的水溶性限制，未能实现SiRhaT68-1的完全底物饱和，因此观察到的催化效率差异应视为初步结果。这些来自独立体外实验的发现为雪莲中黄酮糖基化提供了分子层面的见解，并将SiUGT03和SiRhaT68-1确定为进一步研究芦丁及相关糖苷生物合成的候选酶。