2B9-Fc通过抑制STAT1介导的M1型巨噬细胞极化与扩增调节性T细胞改善免疫性血小板减少症

《International Journal of Molecular Sciences》：2B9-Fc Ameliorates Immune Thrombocytopenia by Suppressing STAT1-Mediated M1 Macrophage Polarization and Expanding Regulatory T Cells

　　

免疫性血小板减少症（immune thrombocytopenia， ITP）是一种自身免疫性出血性疾病，其中血小板破坏增强与血小板生成受损并存，且相当比例的患者对现有疗法无效。本研究评估了2B9-Fc——一种由环肽工程化改造、对人源和鼠源c-MPL均具有高亲和力的血小板生成素（thrombopoietin， TPO）模拟肽——在被动（抗CD41单克隆抗体R300）和主动（豚鼠抗小鼠血小板血清， guinea pig anti-mouse platelet serum， GP-APS）免疫诱导的雄性C57BL/6J及人源化c-MPL受体转基因小鼠ITP模型中的作用。2B9-Fc（500 μg/kg，皮下注射）在两个模型中均显著升高外周血小板计数（p < 0.01），且不影响白细胞、红细胞或血红蛋白水平，并在主动模型中减轻皮肤紫癜和出血评分。此外，2B9-Fc治疗与脾脏M1/M2巨噬细胞比例降低、调节性T细胞（regulatory T cells， Tregs）增加、IL-6和iNOS下调同时TGF-β1和Foxp3上调、以及STAT1磷酸化受抑相关。在人源化c-MPL受体转基因（MT）小鼠中，2B9-Fc在体外促进CD41+巨核细胞生成，并在体内维持血小板恢复至第14天。这些结果表明，2B9-Fc可改善ITP，并与促进巨核细胞成熟和恢复免疫耐受相关，其机制可能涉及抑制STAT1介导的M1型极化和Treg扩增，从而支持其临床转化潜力。

研究背景与科学问题

免疫性血小板减少症（immune thrombocytopenia， ITP）是一种以孤立性血小板减少（<100 × 10⁹/L）为特征的自身免疫性出血性疾病，其发病机制涉及血小板破坏增强和血小板生成不足两方面。传统疗法包括糖皮质激素、静脉注射免疫球蛋白（intravenous immunoglobulin， IVIG）和脾切除术，但许多患者无法获得充分或持久的应答，难治性ITP仍是临床挑战。血小板生成素受体激动剂（thrombopoietin receptor agonists， TPO-RAs），如重组人血小板生成素（recombinant human thrombopoietin， rhTPO）、艾曲泊帕、阿伐曲泊帕和罗米司亭，通过激活c-MPL受体促进巨核细胞分化和血小板生成，已成为二线治疗方案。然而，约20–30%的慢性ITP患者对现有TPO-RAs应答不佳或不能耐受，且小分子TPO-RAs在啮齿类动物及其他非人灵长类中缺乏活性，限制了临床前评价。因此，开发具有新型结构、长效作用、低免疫原性和跨物种活性的TPO模拟肽具有重要价值。此前，研究人员以已报道的鼠源c-MPL结合肽AF12193为骨架，通过筛选随机突变噬菌体展示肽库，分离得到一种对人源和鼠源c-MPL均具有高亲和力的环肽2B9，将其与人IgG1的Fc片段融合后获得长效TPO模拟肽2B9-Fc。本研究旨在系统评估2B9-Fc在被动和主动免疫ITP小鼠模型中的疗效及其机制，重点关注免疫调控（巨噬细胞极化、调节性T细胞和树突状细胞）和巨核细胞生成，并利用人源化c-MPL受体转基因小鼠验证其对人类受体的直接激活作用，为临床转化提供依据。

关键技术方法

研究人员采用以下主要技术方法：建立被动免疫ITP模型（皮下注射抗CD41单克隆抗体R300）和主动免疫ITP模型（腹腔注射豚鼠抗小鼠血小板血清， GP-APS）；使用全自动血液分析仪进行外周血细胞计数；通过流式细胞术分析脾脏和骨髓中免疫细胞亚群（包括M1/M2巨噬细胞、调节性T细胞、树突状细胞、B细胞和T细胞）；采用实时定量PCR检测脾脏中M1/M2极化相关基因（IL-6、iNOS、TNF-α、Arg-1、TGF-β1、Foxp3）的表达；通过Western blot检测脾脏中STAT1总蛋白和Tyr701位点磷酸化水平；利用人源化c-MPL受体转基因（MT）小鼠进行体外巨核细胞生成实验和体内活性ITP模型验证；采用Giemsa染色观察巨核细胞形态；苏木精-伊红（H&E）染色观察脾脏组织病理学变化。

研究结果

2.1 2B9-Fc在被动免疫ITP模型中提升外周血小板计数及血液学参数：在R300诱导的被动模型中，2B9-Fc从第2天起快速促进血小板恢复，第5天达到峰值（2403 ± 561 × 10⁹/L），显著高于模型对照组（414 ± 162 × 10⁹/L），效果持续至第7天，且对白细胞、红细胞和血红蛋白无显著影响。

2.2 2B9-Fc调节被动免疫ITP模型骨髓和脾脏的免疫细胞组成：流式细胞术显示，在骨髓中，2B9-Fc将异常升高的树突状细胞、巨噬细胞和B细胞比例恢复至正常水平，并增加T细胞比例；在脾脏中，2B9-Fc恢复树突状细胞和巨噬细胞比例并进一步扩增T细胞，呈现器官特异性的免疫重塑作用。

2.3 2B9-Fc缓解主动免疫ITP模型的血小板减少和皮肤紫癜：在GP-APS诱导的主动模型中，2B9-Fc显著抑制血小板下降，从第1天起血小板即显著高于模型组，并明显减轻背部及四肢皮肤的瘀点和斑片状紫癜，对白细胞、红细胞和血红蛋白无影响。

2.4 2B9-Fc促进主动免疫ITP模型的Treg分化并调节巨噬细胞极化：流式细胞术发现，2B9-Fc治疗后，脾脏M1型巨噬细胞（CD11b⁺F4/80⁺CD86⁺）比例显著降低，M2型（CD11b⁺F4/80⁺CD206⁺）比例恢复，M1/M2比值显著下降；同时，CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺调节性T细胞比例进一步升高，超过模型组的代偿性升高水平。

2.5 2B9-Fc对脾脏M1/M2极化相关基因表达及STAT1信号通路的影响：qPCR结果显示，2B9-Fc下调M1相关促炎因子IL-6和iNOS的mRNA表达，上调M2/Treg相关因子TGF-β1和Foxp3的表达。Western blot表明，模型组脾脏中磷酸化STAT1（p-STAT1）/总STAT1比值显著升高，2B9-Fc显著降低该比值，接近正常水平。

2.6 2B9-Fc激活人源化c-MPL受体并提升人源化ITP模型血液学参数：在MT小鼠体外实验中，2B9-Fc处理组可见大量典型分叶核巨核细胞，CD41⁺巨核细胞比例（19.40% ± 3.31%）显著高于PBS对照组（5.36% ± 1.72%）。在MT小鼠主动ITP模型中，2B9-Fc从第3天开始恢复血小板，效果持续至第14天，脾指数进一步增加，组织学证实为髓外造血所致。

讨论与结论

讨论部分指出，2B9-Fc的治疗机制可能涉及双重方向作用：一方面直接激活c-MPL驱动巨核细胞增殖、成熟和血小板释放，快速补充外周血小板；另一方面通过抑制STAT1磷酸化阻断M1型极化，减少炎症性脾脏微环境中的血小板破坏，并与Treg扩增及自身免疫耐受恢复相关联。研究也承认了若干局限性，包括未进行剂量优化、未与已批准的TPO受体激动剂进行头对头比较、机制证据主要为表型相关性、未使用慢性ITP模型以及尚未在非人灵长类中进行药效学和安全性评价。结论部分总结认为：2B9-Fc作为一种新型TPO模拟肽，在被动和主动免疫ITP小鼠模型中均发挥显著治疗效应，提升外周血小板计数并改善出血症状和脾脏病理损伤；其机制涉及促进巨核细胞成熟，并与抑制巨噬细胞M1极化、扩增Treg及恢复免疫耐受相关；2B9-Fc还能激活人源c-MPL受体，在MT小鼠中表现出持续的血小板生成活性，支持其作为下一代TPO受体激动剂的临床转化潜力。