吡咯并胞嘧啶作为RNA-小分子相互作用的荧光传感器

《International Journal of Molecular Sciences》：Pyrrolocytosine as a Fluorescent Sensor of RNA–Small Molecule Interactions

　　

：荧光碱基类似物已被证明是研究RNA结构的有价值探针。吡咯并胞嘧啶（pC）作为胞嘧啶的类似物，在RNA内表现出高度环境敏感的荧光特性，且在氢键结合环境中被强烈淬灭。在本研究中，研究人员将pC引入枯草芽孢杆菌（B. subtilis）鸟嘌呤核糖开关的适配体结构域，以探究这种淬灭机制是否能够用于感知RNA-小分子相互作用。研究人员利用互补的荧光光谱学方法，研究了位于结合口袋远端及内部的pC取代对功能的影响和配体敏感性。研究发现，位于静态结构区域内的pC取代表现出预期的与配体无关的荧光特性。当pC位于配体结合口袋内时，其对配体鸟嘌呤（G）和次黄嘌呤（Hx）的亲和力适度降低，同时保持对G的高度特异性。研究结果表明，pC表现为一种关闭型传感器，在G或Hx结合时产生明显的荧光变化。这些差异取决于与pC形成的氢键数量，并且可以在时间分辨和稳态荧光测量中分辨出来。研究结果证明，pC可用于研究RNA-小分子相互作用，并且即使配体具有相同的结合模式，pC也能区分结构相似的配体。

论文解读

一、研究背景与科学问题

数十年的RNA研究已将其生物学角色从简单的遗传信息载体拓展为具有广泛调控功能的分子。非编码RNA（ncRNA）以及信使RNA（mRNA）非编码结构域（即“非翻译区”，UTR）已被证明在细菌基因表达调控中发挥重要作用，其失调与多种疾病状态相关。因此，ncRNA和UTR中的基序作为潜在治疗靶点受到越来越多的关注。核糖开关（riboswitch）主要存在于细菌mRNA的5′ UTR中，代表了一类备受关注的功能性RNA基序。核糖开关通过适配体结构域结合环境中的配体，在结合后发生构象变化，进而通过连接两个结构域的开关序列诱导表达平台发生进一步结构变化，实现对下游基因的配体依赖性调控。

基于结构的天然核糖开关配体修饰已被证明是初始药物候选设计的可行途径，新型合成配体靶向核糖开关也已在不同细菌菌株中显示出调控效果。因此，更深入地理解配体结合如何与适配体结构域内的局部构象耦合，有助于设计可能成为药物候选的新型配体。

基于荧光的方法被广泛用于研究RNA在溶液中的结构及其对环境刺激的响应，但这需要标记一种对RNA结构敏感且扰动最小的探针。荧光碱基类似物（FBA）是天然核酸碱基的结构模拟物，具有更高的荧光量子产率，可被引入RNA的感兴趣位点。许多FBA表现出环境敏感荧光，使其成为研究局部核酸结构的有用探针。

吡咯并胞嘧啶（pC）最早被用作脱氧胞苷类似物来研究转录泡中RNA:DNA杂合体的形成。近期研究利用pC研究核酶折叠以及tRNA与T-Box核糖开关之间的分子间相互作用。先前的研究表明，在DNA寡核苷酸中，pC在碱基堆叠构象中表现出荧光增强，而氢键作用会淬灭其荧光。在此基础上，研究人员近期证明，碱基堆叠和氢键对pC光物理性质的影响在RNA中同样存在，同时还存在此前在DNA中未报道的强序列依赖性。此外，pC在双链体中的碱基配对状态可通过荧光寿命测量解析为一个高占据、快速衰减的时间组分，其发射光谱线型可作为局部极性的报告器。

然而，利用pC独特的荧光性质来研究RNA与小分子相互作用的潜在应用尚未被探索。广泛使用的2-氨基嘌呤（2-AP）虽已用于理解核糖开关的配体依赖性构象变化，但通常被置于适配体结构域中不直接与配体相互作用的远端区域，或在少数情况下用作配体类似物。与2-AP等主要通过碱基堆叠淬灭的FBA不同，pC的氢键依赖性淬灭特性为其在依赖胞嘧啶残基与配体间氢键的核糖开关中作为直接关闭型配体结合传感器提供了机会。

鸟嘌呤核糖开关（GR）适配体结构域通过Watson-Crick-Franklin（WCF）氢键模式与保守胞嘧啶碱基C74配位，以不同亲和力结合鸟嘌呤（G）及其代谢衍生物。该核糖开关通过混合的构象选择/诱导契合模型发挥作用，其三叉连接区大部分预组织，而未杂交的连接子（J2/3）在两个相邻茎环之间采样“开放”和“关闭”构象，其中只有开放构象能够结合配体。研究人员假设，pC取代C74可以作为配体结合的构象敏感报告器，而pC取代其他位置则可以揭示配体结合是否与结合口袋远端的构象变化耦合。

二、研究内容与主要结论

本研究利用稳态和时间分辨光谱学方法监测GR内pC的荧光特性对具有不同亲和力和氢键程度的配体结合的响应。研究人员选择了枯草芽孢杆菌GR适配体结构域69核苷酸序列中的两个pC标记位点：第71位和第74位。第71位位于P3螺旋内，独立于Mg2?和配体始终保持碱基配对状态。第74位取代了配体配位的关键胞嘧啶残基。

研究结果表明，pC71在P3螺旋内保持稳定的碱基配对状态，其荧光特性在加入Mg2?或配体后基本不变，表明pC取代对高度结构化区域扰动极小。pC74则表现出配体依赖性荧光淬灭，在饱和浓度G存在下荧光强度降低约40%，Hx仅诱导约30%的降低，荧光淬灭程度与配体形成的氢键数量直接相关。通过荧光滴定确定的表观解离常数（K_D）表明，pC取代在A21U/U75A背景下适度降低了结合亲和力，同时保持了高特异性。时间相关单光子计数（TCSPC）揭示了pC74在结合口袋内采样的多种构象状态，包括碱基堆叠、非堆叠、螺旋外和氢键结合构象。荧光检测圆二色（FDCD）光谱证实了配体结合对碱基堆叠构象的淬灭效应。停流荧光光谱学进一步确定了G和Hx的结合速率常数，证明pC可用于RNA-小分子配体结合的动力学研究。

三、关键技术方法

本研究采用了多种互补的光谱学技术。稳态荧光光谱用于监测pC标记GR的发射和激发光谱及其对配体的响应。时间相关单光子计数（TCSPC）用于解析pC荧光衰减动力学，通过指数和伽马分布模型拟合确定不同构象状态的寿命和占据权重。圆二色（CD）和荧光检测圆二色（FDCD）光谱用于研究RNA的全局和局部构象。停流荧光光谱学用于测定配体结合动力学。此外，量子力学（QM）计算在CIS(D)/aug-cc-pVDZ理论水平上评估了pC序列环境中是否存在低能电荷转移态。RNA样品通过T4 RNA连接酶2介导的splint连接法制备。

四、研究结果

2.1 pC基GR传感器的设计

GR被选为模型系统，因为其配体特异性由关键胞嘧啶残基C74赋予，且枯草芽孢杆菌GR适配体结构域已得到广泛的生化和结构表征。研究人员选择了第71和74位两个标记位点。第71位位于P3内，独立于Mg2?和配体保持碱基配对。第74位取代配体配位胞嘧啶。为优化传感器，研究人员利用A21U/U75A补偿突变将pC74置于更有利的ApCA序列环境中。QM计算表明所考虑的序列环境中不存在低能电荷转移态。

2.2 pC71表现出稳定的碱基配对

pC71 GR的发射和激发光谱在加入1 mM Mg2?后无强度或线型变化，加入饱和G或Hx后仅略有降低。TCSPC测量显示pC71荧光衰减以1.1 ns组分占绝对主导（权重0.99），表明pC71被约束在P3内主要为碱基配对构象。8.4 ns组分可能来自罕见的呼吸事件导致的碱基堆叠但未配对构象。加入G或Hx后各组分的寿命和权重无显著变化。pC71 GR的圆二色（CD）谱与未修饰GR相比不变，表明pC取代对RNA内高度结构化区域扰动极小。

2.3 模型RNA揭示pC与G或Hx间氢键的光物理影响

研究人员构建了含中心ApCA基序的21核苷酸单链和双链模型RNA。完全互补双链体1:2UGU和1:2UIU均显示亚纳秒衰减组分，寿命分别为0.90和0.57 ns，权重分别为0.86和0.58，归属于碱基配对构象。所有三种双链体均显示约5.5 ns组分，其权重与pC氢键程度成反比：pC对G为0.10，对I为0.19，对U为0.51，归属于非堆叠构象。三种双链体还均显示约13 ns组分，归属于“呼吸打开”的碱基堆叠但未配对构象。错配双链体1:2UUU还显示2 ns衰减组分（权重0.35），表明其AU富集核心的局部碱基堆叠稳定性较弱。

2.4 pC74表现出配体依赖性荧光淬灭并保持结合特异性

pC74 GR在无配体时表现出pC在碱基堆叠构象中的预期荧光增强。在配体存在下，发射光谱可区分G和Hx，整体强度降低与配体形成氢键数量直接相关。加入饱和G导致约40%强度降低，Hx仅诱导约30%降低。荧光滴定在1 mM和20 mM Mg2?浓度下确定G和Hx的K_D值。在20 mM Mg2?下，G的K_D为35 ± 3 nM，Hx为12.1 ± 0.2 μM；在1 mM Mg2?下，G为80 ± 10 nM，Hx为41 ± 4 μM。pC74在A21U/U75A背景下适度降低结合亲和力，同时保持相同数量级的表观K_D值和对G的高特异性。对照实验表明pCr在配体存在下无荧光变化，确认荧光降低源于配体结合而非光损伤或非特异性相互作用。

2.5 pC74的构象系综

所有pC74 GR衰减均以3E模型良好拟合。所有条件下均存在14 ns组分，归属于碱基堆叠且未配对状态。无配体时该堆叠状态为主导构象（RNA单独为0.44，+1 mM Mg2?为0.51）。加入饱和配体后该群体减少，减少程度与配体氢键程度相称（G为0.21，Hx为0.36）。所有条件均显示中间长度衰减组分，从无配体状态的7 ns变为配体存在时的5.5 ns，权重约0.30，归属于未配对且非堆叠状态。两种配体均诱导群体向短衰减组分转移，归属于碱基配对且堆叠状态。G存在时该2 ns组分成为主导群体（权重0.45）；Hx存在时该群体与碱基堆叠未配对状态权重相等（0.34），且寿命为1.5 ns，比G结合态衰减更快。该状态寿命与pC氢键程度成反比。

意外的是，pC74 GR在无配体时也显示1.5 ns衰减组分（权重0.24）。酸性条件（pH 4）下变性实验表明，变性后pC71、pC74和St1ApCA中的pC均能显著占据“核糖苷样”状态，即螺旋外构象。无配体天然条件下，pC74能够采样完全从J3/1连接子翻出的螺旋外构象，该状态被pC与配体氢键结合的特征性高占据构象所克服。

2.6 FDCD揭示配体诱导的碱基堆叠构象淬灭

标准CD谱显示A型双链RNA特征线型，加入Mg2?、G或Hx后无变化，与核糖开关预组织为三个碱基配对螺旋结构域主导的全局结构一致。FDCD谱显示pC74 GR和St1ApCA均在pC最长波长吸收带呈现正特征，在短波长处呈现由邻近天然碱基激发后能量转移至pC产生的S形特征。pC74 GR的短波长特征强度高于St1ApCA，表明更多碱基参与向pC74的能量转移。加入饱和G后整个FDCD谱强度显著降低，表明G结合淬灭了pC与邻近碱基具有最强CD信号的构象亚群。Hx诱导的FDCD降低小于G，与TCSPC观察到的亮态到暗态堆叠构象群体转移程度较小一致。

2.7 停流荧光光谱揭示配体结合速率差异

停流荧光测量在伪一级条件下进行，pC74 GR浓度为55 nM，配体过量。pC74在G和Hx引入后均表现出清晰的时间依赖性荧光淬灭。G的k_assoc为4.1 × 10? M?1s?1，Hx为0.033 × 10? M?1s?1。G的k_assoc值与2-AP结合C74U GR在1.25 mM Mg2?下测定的速率（4.4 × 10? M?1s?1）几乎相同。双指数拟合的必要性可能反映了GR采样“关闭”和“开放”状态的结合模型，其中只有后者能够结合配体。

五、总结与讨论

本研究证明pC可作为多方面的、最小扰动的探针，报告核糖开关内特定核苷酸采样的构象，并可作为配体结合的直接传感器。pC74的配体依赖性淬灭使得能够分析GR结构和功能的多个方面，包括对不同配体的亲和力、结合口袋内的构象系综以及配体结合动力学。pC取代即使替换关键配体结合残基也能保持GR的基本特性，如由配体氢键数量决定的独特结合亲和力和动力学。pC能够在结合口袋的复杂环境中采样碱基堆叠、非堆叠、螺旋外和氢键结合构象，这些构象表现出不同程度的荧光淬灭或增强。这些发现为pC在生物学和技术感兴趣的复杂RNA中的更广泛应用建立了框架。

结论部分指出，pC作为一种多功能、最小扰动的探针，能够报告核糖开关内特定核苷酸采样的构象，并作为配体结合的直接传感器。pC取代即使替换关键配体结合残基也能保持GR的基本特性。pC能够在结合口袋复杂环境中采样多种构象，表现出不同程度的荧光淬灭或增强。这些发现为pC在复杂RNA中的更广泛应用建立了框架。