《International Journal of Molecular Sciences》：Functional Characterization of ClHSP22.9 Promoter from Wild Watermelon (Citrullus lanatus) Reveals Heat- and Drought-Inducible Transcriptional Activity
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纤维素纳米纤丝（cellulose nanofibrils, CNFs）和TEMPO氧化纤维素纳米纤丝（TEMPO-oxidized cellulose nanofibrils, TOCNFs）是水合的高长径比生物材料，具有可调控的理化性质，而人源细胞外基
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纤维素纳米纤丝（cellulose nanofibrils, CNFs）和TEMPO氧化纤维素纳米纤丝（TEMPO-oxidized cellulose nanofibrils, TOCNFs）是水合的高长径比生物材料，具有可调控的理化性质，而人源细胞外基质（extracellular matrix, ECM）水凝胶则可提供基质相关的生化信号。在本研究中，研究人员开发了基于CNF和TOCNF的复合支架，并掺入人源ECM水凝胶组分，在体外评估其作为皮肤创面修复相关平台的可行性。复合配方在生理温度下可发生凝胶化，并表现出配方依赖的剪切变稀行为、弹性特征、蛋白释放/浸出曲线以及多孔纤维状微观结构。所选配方在二维和三维培养条件下均可支持人真皮成纤维细胞和脂肪来源基质/干细胞（adipose-derived stromal/stem cells, ASCs）的细胞相关代谢活性。额外的探索性研究表明，该材料与成脂分化培养具有定性相容性，并观察到创面间隙宽度出现条件依赖性变化。由于缺乏体内验证及确证性生物学检测，上述结果应被解读为概念验证性发现，而非创面愈合功效的直接证据。总体而言，研究结果表明，将CNF或TOCNF结构网络与人源ECM水凝胶相结合，可构建具有创面相关材料特性和初步细胞相容性的复合支架，为后续机制研究和临床前评估提供了支持。
论文解读
一、研究背景与科学问题
皮肤创面修复是一个高度协调的生物学过程，涉及细胞外基质（extracellular matrix, ECM）、常驻及浸润细胞、可溶性介质、血管成分、免疫应答以及开放性创口中的微生物群落之间的复杂相互作用。单一生物材料支架难以完整模拟这一微环境。既往研究多利用三维支架模拟天然ECM及结缔组织架构的特定方面，以提供与细胞行为相关的结构和生物物理信号。
纤维素纳米纤丝（cellulose nanofibrils, CNFs）和TEMPO氧化纤维素纳米纤丝（TEMPO-oxidized cellulose nanofibrils, TOCNFs）是具有纳米级直径和微米级长度的高长径比纤维素结构，其水合网络、表面化学特性、孔隙率和剪切依赖性流动行为使其适用于湿润创面界面和细胞支持支架。然而，纤维素材料本身无法再现人源ECM的组分复杂性。人源脱细胞基质材料虽能提供丰富的生化信号，但其结构力学性能往往不足。
当前存在的核心科学问题是：未经修饰的CNF和经TEMPO氧化修饰的TOCNF在分别与人源ECM按不同配比组合后，其行为差异缺乏系统的比较数据；同时，所得复合材料的流变学特性、微观结构、细胞相关代谢活性、脂肪干细胞相容性及探索性创面间隙应答之间的关系尚不明确。因此，本研究的目的是构建并表征CNF-人源ECM和TOCNF-人源ECM复合支架，通过理化性质和操作性综合评估框架筛选出先导配方，并明确其体外生物学表现的适用范围与局限性。需要指出的是，本研究不涉及临床疗效评估、直接结构降解分析、抗菌活性、炎症调节或体内创面修复评价。
二、研究内容与总体结论
研究人员将CNF和TOCNF分别与人源血源性ECM水凝胶（ObaGel?-ECM）按四种体积配比组合，在生理温度条件下成功制备了复合水凝胶支架。通过系统筛选，确定了先导配方（formulation #4），并对其进行了全面的理化表征和体外生物学评价。研究结果表明，CNF-人源ECM和TOCNF-人源ECM复合支架可在生理温度下凝胶化，表现出配方依赖的剪切变稀行为、弹性特性和多孔纤维状微观结构。所选配方在二维和三维培养条件下均能支持人真皮成纤维细胞和脂肪来源基质/干细胞（adipose-derived stromal/stem cells, ASCs）的细胞相关代谢活性，并显示出与成脂分化培养的定性相容性。在探索性创面间隙闭合实验中，CNF和TOCNF配方均表现出比单纯ECM更显著的间隙闭合效果。这些概念验证性发现支持了将纳米纤维素结构网络与人源ECM生化组分相结合构建复合支架的策略可行性，为后续机制研究和临床前评估奠定了基础。
三、主要关键技术方法
本研究采用了多项关键技术手段。人源ECM材料为ObaGel?-ECM A和ObaGel?-ECM B，由Obatala Sciences Inc.生产，其来源组织经美国国家疾病研究交换中心（National Disease Research Interchange）在伦理协议RGIJ1 01 001A和002A下从知情同意供体获取。CNF和TOCNF来自缅因大学工艺开发中心，其中棉源CNF由棉铃纤维素的加工副产物制备。水凝胶复合配方采用流变学分析（Discovery TA HR-2流变仪，涵盖黏度测定、频率扫描、温度爬升及浸泡后模量测定）、扫描电子显微镜（SEM）结合DiameterJ图像分析（评估孔径、孔隙率、纤维直径和交叉密度）、Pierce BCA蛋白定量及蛋白释放/浸出分析、蛋白质组学分析、alamarBlue细胞代谢活性检测、核染色定量、成脂分化可行性研究以及基于插入式培养的创面间隙闭合实验等方法进行系统评价。
四、研究结果
4.1 水凝胶组成、视觉特征、蛋白释放与蛋白质组学
CNF和TOCNF在溶液中均呈均一分散状态，无沉淀现象。TOCNF因透明度最高而最易于目视观察。蛋白质组学分析确认了ECM组分以细胞外基质蛋白为主，包括胶原蛋白和纤连蛋白。在CNF和TOCNF中均鉴定到一种共同蛋白——来自陆地棉（Gossypium hirsutum）的53 kDa核酮糖二磷酸羧化酶大链（P14958）。两种纳米纤维系配方#4的总蛋白含量相近。PBS上清液中检测到的蛋白被解读为蛋白释放或浸出，而非支架整体结构降解的直接指标。
4.2 流变学表征
CNF和TOCNF及其配方#4混合物均表现出剪切依赖性流动行为。值得注意的是，1%（w/v）CNF单独溶液出现黏度急剧下降，研究人员将其归因于CNF基材料的聚集倾向，而TOCNF未出现该现象。温度爬升实验表明，配方刚度在20 °C后发生变化，并在37 °C下稳定。储能模量（G′）数值与既往报道的CNF、TOCNF及其他生物聚合物（如海藻酸盐）相当，且与间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）在CNF膜上培养时报道的弹性剪切模量相近。TOCNF配方#4的储能和损耗模量低于纳米纤维含量更高的配方#2和#3。
4.3 SEM图像分析
代表性SEM图像显示CNF和TOCNF配方#4均具有多孔纤维状微观结构。通过DiameterJ插件对孔径、孔隙率、纤维直径和交叉密度进行定量分析，双因素方差分析（two-way ANOVA）未发现各水凝胶条件之间存在统计学显著差异，因此图像差异仅作描述性解读。
4.4 细胞相关代谢活性
人真皮成纤维细胞在配方#4水凝胶表面培养或包埋培养后，在第1至7天均表现出细胞相关代谢活性（alamarBlue还原法，经无细胞对照校正）。核染色定量分析显示CNF条件为133.7 ± 48.1个核/视野，TOCNF条件为166.3 ± 6.0个核/视野，变异系数分别为36.0%和3.6%。这些结果支持该材料与人真皮成纤维细胞的相容性。
4.5 成脂分化
在31天可行性研究中，ASCs在PCL NanoECM?纤维上涂覆配方#4 CNF或TOCNF后培养7天，随后在AdipoQual培养基中诱导成脂分化。第21天观察到明显的成脂分化，并维持至第31天，细胞内可见无标记脂滴。该定性观察支持材料的长期成脂相容性，但未建立脂滴大小、成脂程度或配方优劣的定量比较。
4.6 探索性创面间隙闭合实验
以ASCs为细胞模型进行创面间隙分析。第2天创面闭合率分别为：ObaGel?-ECM组1.9 ± 2.4%，配方#4 CNF组64.3 ± 5.4%，配方#4 TOCNF组60.0 ± 9.5%。代表性染色图像显示ObaGel?-ECM条件仍存在持续开放区域，而CNF和TOCNF条件下创面区域细胞占据明显更多。创面宽度变化反映细胞运动、铺展、存活和增殖的综合效应，属于复合性创面间隙应答而非迁移特异性终点。
五、讨论与结论
讨论部分指出，本研究证明了CNF和TOCNF可分别与人源ECM组分复合制备混合水凝胶，其流变学性质、多孔形态和体外细胞相容性均可测量和验证。复合支架设计的合理性在于将CNF或TOCNF的水合纤维结构和配方依赖的力学特性与人源ECM的生化复杂性相结合。创面间隙实验中，CNF和TOCNF配方#4均比单纯ObaGel?-ECM表现出更显著的间隙闭合效果，且未观察到细胞毒性。这些结果与此前关于TOCNF无毒性以及CNF黏附创面床并支持再上皮化的研究一致。
研究局限性包括：多批次生物重复间的批次间变异性、缺乏正交的增殖检测、脂滴/细胞的定量评估缺失、未进行抗菌、生物膜、炎症和免疫细胞检测，以及缺乏体内创面愈合研究。未进行任何人体临床试验。未来研究应将释放测量与重量分析、溶胀、随时间变化的流变学、结构成像和生化完整性检测相结合。
研究结论为：CNF-人源ECM和TOCNF-人源ECM复合支架可在生理温度条件下凝胶化，表现出配方依赖的流变学特性和多孔微观结构。所选配方支持真皮成纤维细胞和ASCs的细胞相关代谢活性，与成脂培养具有定性相容性，并在探索性创面间隙闭合中表现良好。这些概念验证性发现支持进一步的机制和临床前评估，而非临床疗效的结论。治疗获益的证实需要定量多供体研究、支架降解和宿主应答的综合评估，以及在适当的临床前创面愈合模型中的验证。该研究已申请美国专利（申请号19/193,179，2025年4月29日提交，题为“Cellulose Nanofiber-Based Hydrogels Containing Wound-Healing Adjuvants”）。
