《International Journal of Molecular Sciences》：Development of Hydrogel-Cellulose Nanofiber Hybrid Scaffolds for Potential Cutaneous Wound-Healing Applications
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摘要：纤维素纳米纤丝（CNFs）和TEMPO氧化纤维素纳米纤丝（TOCNFs）是具有可调控理化性质的高含水率、高长径比生物材料，而人源细胞外基质（ECM）水凝胶则提供与基质相关的生化信号。在本研究中，研究人员开发了基于CNF和TOCNF并掺入人源ECM水凝胶组
摘要：纤维素纳米纤丝（CNFs）和TEMPO氧化纤维素纳米纤丝（TOCNFs）是具有可调控理化性质的高含水率、高长径比生物材料，而人源细胞外基质（ECM）水凝胶则提供与基质相关的生化信号。在本研究中，研究人员开发了基于CNF和TOCNF并掺入人源ECM水凝胶组分的杂化支架，并在体外评估其作为皮肤伤口修复相关平台的可行性。杂化配方在生理温度下形成凝胶，并表现出依赖配方的剪切稀化行为、弹性特性、蛋白质释放/浸出曲线以及多孔纤维状微观结构。选定的配方在二维和三维培养条件下均支持人真皮成纤维细胞和脂肪来源间充质干细胞（ASCs）的细胞相关代谢活性。额外的探索性研究表明，该支架与成脂分化培养具有定性相容性，且伤口间隙宽度呈现条件依赖性变化。由于缺乏体内验证和确证性生物学检测，这些发现被解读为概念验证性证据，而非伤口愈合疗效的直接证明。总体而言，研究结果表明，将CNF或TOCNF结构网络与人源ECM水凝胶相结合，能够制备出具有伤口修复相关材料特性和初步细胞相容性的杂化支架，为进一步的机制研究和临床前评价提供了依据。
论文解读文章
研究背景与科学问题
皮肤伤口修复是一个复杂的生物学过程，涉及细胞外基质（ECM）、驻留及浸润细胞、可溶性介质、血管成分、免疫反应以及微生物群落的协同作用。尽管生物材料支架无法完全重建这一微环境，但其常被用于模拟天然ECM和结缔组织结构的特定方面，从而为细胞行为提供结构和生物物理线索。纤维素纳米纤丝（CNFs）和TEMPO氧化纤维素纳米纤丝（TOCNFs）因其高长径比、水合网络、表面化学特性、孔隙率和剪切依赖性流动行为，在湿润创面界面和细胞支持支架领域展现出吸引力。然而，单独的纤维素材料无法复制人源ECM的组成复杂性。因此，将纳米纤维素提供的结构力学性能与人源ECM的生物化学组成结合于同一杂化支架中，成为解决上述问题的潜在策略。当前研究的科学空白在于：关于未修饰CNF和TOCNF分别与人源ECM在不同配比组合下的行为，以及由此产生的杂化材料在流变学、微观结构、细胞相关代谢活性、脂肪干细胞相容性和探索性体外伤口间隙反应方面的比较信息十分有限。
研究目的与意义
本研究旨在配制并表征CNF-人源ECM和TOCNF-人源ECM杂化支架，利用综合的物理化学和处理特性框架确定领先配方，并界定其体外生物学性能的范围和局限性。该研究不评估临床疗效、直接结构降解、抗菌活性、炎症调节或体内伤口修复效果。研究成果为后续的机制研究和临床前评价提供了概念验证基础。
关键技术方法
研究人员使用了来自木材和棉花的CNF和TOCNF，以及由Obatala Sciences公司生产的商品化人源血液衍生水凝胶ECM材料ObaGel?-ECM。关键方法包括：按不同体积混合比制备CNF/TOCNF与ECM的杂化水凝胶配方；利用Discovery TA HR-2流变仪进行粘度、频率扫描、温度斜坡及浸泡后模量测量；采用Pierce BCA蛋白测定法检测水凝胶蛋白含量及释放/浸出蛋白；使用配备Gatan Alto 2500冷冻系统的Hitachi S-4800扫描电镜（SEM）观察微观结构，并通过DiameterJ插件分析孔径、孔隙率、纤维直径等参数；通过alamarBlue还原实验评估人真皮成纤维细胞在二维涂层和三维包埋培养中的细胞相关代谢活性；在聚己内酯（PCL）NanoECM?支架上进行人脂肪来源间充质干细胞（ASCs）的成脂分化可行性研究；利用Abcam伤口愈合测定试剂盒建立细胞间隙模型，进行探索性伤口间隙闭合分析。
研究结果
2.1 水凝胶组成、视觉特征、蛋白释放及蛋白质组学
研究人员制备了四种不同配比的CNF/TOCNF与ECM杂化配方（#1-#4）。所有配方在37°C孵育30分钟后均能形成凝胶。TOCNF配方透明度最高，有利于观察。蛋白质组学分析确认ECM组分富含胶原蛋白和纤连蛋白等ECM相关蛋白。BCA测定显示，CNF和TOCNF的#4配方预凝胶混合物的总蛋白含量相似。在PBS上清液中检测到的蛋白随时间增加，被解释为蛋白释放或浸出，而非支架本体降解的直接证据。
2.2 流变学表征
流变学测试表明，所有CNF、TOCNF及其#4配方混合物均表现出剪切依赖性流动行为。值得注意的是，1%（w/v）的纯CNF溶液因聚集倾向而显示出粘度急剧下降，而TOCNF则无此现象。#4 TOCNF配方呈现出平滑的渐近粘度/剪切曲线。频率扫描显示配方具有弹性特性，储能模量（G'）和损耗模量（G''）呈频率依赖性。温度斜坡实验表明，配方刚度在超过20°C后发生变化，并在37°C时趋于稳定。TOCNF #4配方的储能模量和损耗模量低于更高纳米纤维含量的TOCNF #2和#3配方。这些数据支持了配方依赖性的剪切依赖和弹性行为。
2.3 SEM图像分析
代表性SEM图像显示CNF和TOCNF #4配方水凝胶具有多孔纤维状微观结构。通过DiameterJ插件对孔径面积、孔隙率百分比、纤维直径和交叉点密度进行的定量分析，经双因素方差分析（Two-way ANOVA）检验，各水凝胶条件之间未发现统计学显著差异，因此图像变异被描述性地解读，而非结构差异的证据。
2.4 细胞相关代谢活性
人真皮成纤维细胞在#4配方水凝胶表面培养或包埋于其中培养，在第1至7天均表现出细胞相关代谢活性（通过alamarBlue还原测定）。补充的核染色定量分析显示，CNF和TOCNF条件下的平均细胞核数分别为133.7±48.1个/视野和166.3±6.0个/视野。这些发现共同支持了该支架与人真皮成纤维细胞的相容性。
2.5 成脂分化
在一项为期31天的可行性研究中，ASCs在涂覆有#4配方CNF或TOCNF的PCL NanoECM?支架上培养，诱导成脂分化后，在第21天观察到明显的脂肪生成，并维持至第31天。这些定性观察支持了支架的长期成脂相容性，但并未确立脂滴大小、脂肪生成程度或配方优越性上的差异。
2.6 探索性伤口间隙闭合分析
使用ASCs进行的探索性伤口间隙分析显示，在第2天，ObaGel?-ECM组的伤口闭合率为1.9±2.4%，而#4配方CNF组为64.3±5.4%，#4配方TOCNF组为60.0±9.5%。代表性的Hoechst/鬼笔环肽染色图像显示，在CNF和TOCNF条件下，伤口区域有更多的细胞占据。这些结果表明，与单独使用ECM相比，含有纳米纤维素的配方能更有效地促进伤口间隙的缩小。
讨论与结论总结
讨论部分
研究人员指出，本研究表明CNF和TOCNF可以分别与人源ECM组分复配，生产出具有可测量流变学特性、多孔形态以及与选定人类细胞类型体外相容性的杂化水凝胶。杂化设计的合理性在于结合了纳米纤维素的水合纤维结构和配方依赖性力学性能与人源ECM的生化复杂性。在伤口间隙模型中，与单纯ObaGel?-ECM相比，TOCNF和CNF #4配方均观察到伤口间隙减小，且未观察到细胞毒性，这与先前关于TOCNF和CNF支持再上皮化的研究一致。研究人员认为，这些机械和生物学特性可能通过改善液体吸收和保持、维持水合、保持柔韧性以及实现可调敷料孔隙率来支持伤口愈合应用。同时，研究也指出了多项局限性，包括批次间变异性、缺乏正交增殖测量、脂滴定量评估、抗菌/炎症/免疫细胞检测以及体内伤口愈合研究。未来研究需结合重量分析、溶胀、随时间变化的流变学、结构成像和生化完整性测定等方法，并进行充分把握度的多供体研究及适当的临床前伤口模型验证。
结论部分翻译
综上所述，这些发现支持了一种杂化生物材料策略，即将CNF或TOCNF的结构和力学特性与人源水凝胶的生物学复杂性相结合。CNF-人源ECM和TOCNF-人源ECM杂化支架在生理温度条件下形成凝胶，并表现出配方依赖性的流变学特性和多孔微观结构。选定的配方支持真皮成纤维细胞和ASCs的细胞相关代谢活性、与成脂培养的定性相容性以及探索性伤口间隙闭合。这些概念验证性发现支持进一步的机制研究和临床前评价，但不能得出关于临床疗效的结论。证明治疗益处将需要定量的多供体研究、对支架降解和宿主反应的全面评估，以及在适当临床前伤口愈合模型中的验证。
