《International Journal of Molecular Sciences》：Conserved Hepatospora eriocheir Sequences in Chinese Mitten Crabs from Poland, Germany and Belgium: A Comparative Molecular Study
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Hepatospora eriocheir是一种专性胞内微孢子虫，与中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）相关，后者是亚洲重要的水产养殖物种，同时也是欧洲的入侵物种。研究人员对来自欧洲三个地区（波罗的海维斯图拉潟湖（波兰）以及注入北
摘要专业翻译：
Hepatospora eriocheir是一种专性胞内微孢子虫，与中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）相关，后者是亚洲重要的水产养殖物种，同时也是欧洲的入侵物种。研究人员对来自欧洲三个地区（波罗的海维斯图拉潟湖（波兰）以及注入北海的易北河和斯海尔德河流域（德国和比利时））的螃蟹中的寄生虫序列变异进行了考察。在检测的57只中华绒螯蟹中，通过小亚基核糖体RNA（SSU rRNA）测序确认了26例感染，其中包括2022年采集的42份样本中新鉴定的17例感染。寄生虫群体包括13例波兰感染、8例德国感染和5例比利时感染。它们的SSU rRNA序列在794个位置的共享核心区域完全一致，并且所有26条新获得的精氨酰-tRNA合成酶（ArgRS）序列在624个核苷酸长度上完全相同，且与英国参考序列KU695717匹配。两个寄生虫基因片段在四种宿主线粒体细胞色素c氧化酶亚基I（COI）单倍型中均表现一致；与日本绒螯蟹（Eriocheir japonica）相关的单倍型仅在本研究的比利时螃蟹中检测到。该研究首次提供了来自所采样的德国和比利时螃蟹种群中感染的、与个体标本相关联的、经序列确认的分子特征描述，同时提供了2022年新增的波兰感染记录及一个比较性双位点参考数据集。波罗的海区域反复检测到该寄生虫，结合波兰与德国宿主共享COI单倍型以及已有的北海-波罗的海连通性证据，与感染的迁徙螃蟹到达该地区的假设一致，但该寄生虫的确切来源仍未明确。
论文解读文章：
**一、研究背景与科学问题**
中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）在东亚地区是重要的水产养殖物种，同时作为入侵物种被列入欧盟关注的外来入侵物种名单。其降海洄游的生活史使得宿主相关的病原体可能随宿主迁移而扩散，从而影响接收生态系统中宿主-寄生虫的相互作用。Hepatospora eriocheir是一种专性胞内寄生的微孢子虫，感染中华绒螯蟹的肝胰腺上皮细胞，在中国养殖场爆发的肝胰腺坏死病中，检测到类H. eriocheir微孢子虫，并伴随40-50%的报告死亡率。该寄生虫最初在亚洲的中华绒螯蟹中发现，随后在英国泰晤士河口的入侵蟹中被鉴定。尽管已有组织病理学及生理学相关研究，但在欧洲大陆不同地理区域（特别是德国和比利时）的中华绒螯蟹种群中，缺乏与该寄生虫感染相关的、与个体标本相关联的序列确认证据。此前研究仅在波兰维斯图拉潟湖（波罗的海）于2020年分子确认了该寄生虫的存在，提出了寄生虫可能随入侵宿主扩散至波罗的海的科学假设。然而，寄生虫在不同欧洲地理种群的分子多样性、与宿主线粒体单倍型的关系以及其传播路径仍不清楚。开展本研究旨在：(1) 获取德国和比利时北海流域中华绒螯蟹种群中H. eriocheir感染的序列确认证据；(2) 调查2022年维斯图拉潟湖是否再次出现感染个体；(3) 比较不同地理群体和宿主线粒体COI单倍型背景下寄生虫SSU rRNA和ArgRS序列类型，建立比较性参考数据集。
**二、研究内容与主要结论**
研究人员整合了2020年（15只，维斯图拉潟湖）与2022年（42只，包括波兰9只、德国18只、比利时15只）采集的共57只中华绒螯蟹样本。通过SSU rRNA测序确认26例感染（波兰13例、德国8例、比利时5例），其中17例为2022年新检测到的感染。所有26例感染的寄生虫SSU rRNA序列在共享的794个比对位点完全一致，所有26条新生成的ArgRS序列在624个核苷酸片段上也完全一致，并与英国参考序列KU695717匹配。宿主线粒体COI分析显示四种单倍型，其中与日本绒螯蟹相关的EJJ_HP14单倍型仅存在于比利时样本中，且感染状态与宿主COI单倍型之间未发现显著的统计学关联(p = 0.712)。该研究首次提供了德国和比利时中华绒螯蟹种群中与个体标本关联的、经序列确认的H. eriocheir感染分子特征，并建立了双位点比较参考数据集。重复在波罗的海区域检测到该寄生虫，结合波兰-德国共享宿主COI单倍型及北海-波罗的海连通性的既有证据，与感染蟹迁徙到达该地区的解释一致，但寄生虫的确切来源仍无法确定。
**三、主要关键技术方法**
研究人员采用了基于多基因位点的分子检测与比较方法。样本来源包括2020年10月波兰维斯图拉潟湖（托尔克米茨科与弗龙堡之间）商业渔业捕获的15只成年蟹，以及2022年9月德国易北河（霍恩施托夫）、2022年11月比利时斯海尔德流域克莱内内特河（赫罗本东克）和波兰维斯图拉潟湖（弗龙堡）采集的样本。方法主要包括：利用广谱微孢子虫引物MF1/MR1对肝胰腺DNA进行PCR扩增和Sanger双向测序获得SSU rRNA序列确认感染；对全部26例确认感染的个体扩增并测序ArgRS基因；使用LCO1490/HCO2198引物扩增宿主线粒体COI基因并进行单倍型分型；采用MUSCLE进行序列比对，MEGA 11进行最大似然(ML)系统发育分析；使用Fisher-Freeman-Halton精确检验分析宿主单倍型与感染状态的关联性。
**四、研究结果分析**
**2.1 检测Hepatospora eriocheir**：通过对2022年采集的42只中华绒螯蟹进行SSU rRNA测序，确认17例感染（波兰4/9、德国8/18、比利时5/15）。结合2020年15只波兰螃蟹中的数据（其中9例曾报道为阳性），合并数据集共57只螃蟹中确认26例感染。肉眼观察到的肝胰腺形态变化（从紧实的黄色/黄橙色组织到苍白、褪色、松散的组织）与感染状态无一致对应关系，表明仅凭肉眼检查不足以可靠识别感染个体，必须依靠分子确认。
**2.2 宿主COI单倍型与地理背景**：对所有57只螃蟹的COI序列进行比对分析，鉴定出ES_HP1(23/57)、ES_HP2(20/57)、ES_HP4(5/57)和E. japonica相关的EJJ_HP14(9/57)四种单倍型。波兰和德国样本的单倍型组成相近，而比利时样本中EJJ_HP14占60.0%。比利时较高的核苷酸多样性(π = 0.02241)反映了EJJ_HP14的贡献。因样本量不平衡且波兰合并了两年样本，这些描述性指数未用于推断宿主种群结构。
**2.3 寄生虫SSU rRNA和ArgRS序列比较**：26条寄生虫SSU rRNA序列在共享的794个无歧义位点上完全一致，无群体内或群体间差异。与英国参考序列HE584635相比，在789个可比位点存在1个核苷酸差异(99.87%一致性)。所有26条ArgRS序列（624 nt片段）彼此完全一致，且与英国E. sinensis相关参考KU695717完全匹配。而C. pagurus相关(KU695715)和P. pisum相关(KU695716)参考序列与KU695717存在5个位点差异。最大似然系统发育分析将代表性序列置于已发表的Hepatospora参考序列之中。
**2.4 个体水平宿主-寄生虫比较**：在所有四种宿主COI单倍型中均检测到经序列确认的感染：ES_HP1(11/23)、ES_HP2(10/20)、ES_HP4(1/5)和EJJ_HP14(4/9)。Fisher-Freeman-Halton精确检验未发现宿主COI单倍型与感染状态之间存在统计学显著关联(p = 0.712)。在比利时，感染EJJ_HP14和E. sinensis相关线粒体背景的个体中的寄生虫SSU rRNA和ArgRS序列完全一致。由于两个寄生虫位点在所有感染中均无变异，无法进行寄生虫种群结构、迁移方向或宿主-寄生虫系统发育共进化分析。
**五、讨论与结论**
研究人员指出，本研究的主要创新在于首次提供了来自德国易北河和比利时斯海尔德河流域中华绒螯蟹中H. eriocheir感染的、与个体标本关联的序列确认和SSU rRNA-ArgRS双位点特征描述。观察到的序列一致性表明在所检查的样本中存在一种特定的序列类型，但不能证明全基因组克隆性或单一引入事件。保守基因区域、源种群低多样性、相同序列类型的重复到达等因素均可产生相同模式。由于缺乏经核实的中国来源可比对序列记录，无法进行原产地与入侵地多样性的检验。寄生虫在维斯图拉潟湖的重复检出，结合波兰-德国宿主共享COI单倍型及北海-波罗的海连通性的证据，支持寄生虫可能通过迁徙的感染中华绒螯蟹传入波罗的海的假说，但既不能确定德国或比利时为直接来源，也不能区分一次引入还是反复迁移。研究结论为：该研究首次提供了来自德国易北河和比利时斯海尔德河流域中华绒螯蟹中H. eriocheir感染的个体关联分子确认和SSU rRNA-ArgRS特征描述，并记录了2022年波兰新确认的感染。所有26例感染的两个位点寄生虫序列均相同，尽管宿主线粒体单倍型存在变异。维斯图拉潟湖的重复检出与通过迁徙的E. sinensis将寄生虫运输至波罗的海的假说一致，但所检查的位点无法确定地理来源、传播路线或引入次数。
