针对挑战性貂源样本中SARS-CoV-2变异株鉴定的定制化测序策略

《International Journal of Molecular Sciences》：A Tailored Sequencing Approach for Identifying SARS-CoV-2 Variants in Challenging Samples from Mink

高通量测序（High-throughput sequencing, HTS）是包括养殖水貂中SARS-CoV-2在内的传染源基因组监测的重要工具。然而，样本质量参差不齐，阻碍了高质量测序结果的获得。本研究采用两种杂交捕获方法（商业化和定制化）以及一种鸟枪法宏基因组学方法对六份貂源SARS-CoV-2阳性样本进行了测序。所有方法均一致地鉴定出了SARS-CoV-2变异株。宏基因组学方法的比对率（最高达0.35%）、覆盖广度（97–100%）、覆盖深度（9–932×）和平均比对质量值（mean mapq）（30–59）均为最低，且有一个序列未达到质量标准。相比之下，两种杂交捕获方法均获得了更高的比对率（47–99%）、覆盖广度（99.9–100%）和覆盖深度（508–115,846×）。定制化杂交捕获方法因其更优的覆盖均匀度、最少的模糊碱基（N）数量、可调整以适应低RNA水平和降解材料的能力以及简化的实验室工作流程而被选中。为进一步评估其适用性，研究人员将该方法应用于作为常规基因组监测一部分收集的35份临床样本。该方法生成的测序数据具有高比对率（中位数95%）、覆盖深度（中位数13,238×）、覆盖广度（中位数100%）和平均比对质量值（中位数60）。这些发现表明，定制化杂交捕获方法是貂源样本中SARS-CoV-2基因组监测的有用工具。

论文解读：针对挑战性貂源样本中SARS-CoV-2变异株鉴定的定制化测序策略

一、研究背景与问题

除了人类，SARS-CoV-2还能感染多种动物，包括美洲水貂和雪貂。水貂养殖场的高密度圈养模式促进了病毒在动物间的传播。病毒在水貂体内传播过程中可能积累突变，甚至产生新的变异株，并通过反向人畜共患病的方式再次传回人类或感染其他动物，对公共卫生构成潜在风险。因此，欧盟等国际组织推荐对水貂等鼬科动物进行SARS-CoV-2变异株的基因组监测。高通量测序（High-throughput sequencing, HTS）是实现这一目标的主要方法。然而，从常规采集的水貂拭子样本中获得高质量的SARS-CoV-2全基因组序列面临巨大挑战。原因在于：同一养殖场内动物的感染阶段不同，导致咽拭子中病毒遗传物质含量可能很低；此外，样本中可能含有多种导致遗传物质降解的物质，且前处理条件也严重影响样本稳定性。同时，水貂口腔拭子中的宿主及非靶标微生物核酸背景会降低用于病毒基因组重建的测序读段比例。因此，亟需针对这类低质量和低病毒载量的挑战性样本进行方法学优化。

二、研究目的与结论

为了解决上述问题，本研究旨在比较评估三种不同的HTS方法——鸟枪法宏基因组学（shotgun metagenomics, S-MG）、商业化探针杂交捕获法（HC Commercial）和定制化探针杂交捕获法（HC Custom）——对波兰水貂养殖场来源的SARS-CoV-2阳性样本进行全基因组测序的性能。研究进一步确定了处理挑战性貂源样本的最稳健方法，并通过常规基因组监测的临床样本验证了优化后定制化方法的适用性。研究得出结论：所有三种方法均能产生可用于SARS-CoV-2变异株鉴定的高质量结果，其中HC Custom方法表现出最高的灵敏度、最均匀的覆盖度和最少的模糊碱基，尤其适用于低病毒载量和降解的样本，是水貂源样本基因组监测的有效工具。

三、关键技术方法

研究人员首先对6份SARS-CoV-2阳性水貂口腔拭子样本（S1–S6），分别采用三种文库制备方案进行测序比较：基于KAPA HyperPlus试剂盒的鸟枪法宏基因组学方法（S-MG）；基于KAPA RNA HyperCap Workflow v1.0的商业化探针富集方法（HC Commercial），使用Roche公司的KAPA HyperCap SARS-CoV-2探针面板；以及同样使用该探针面板但经过多项优化的定制化探针富集方法（HC Custom）。HC Custom的关键改进包括：在反转录后增加双链DNA（dsDNA）质量控制节点；根据样本产量灵活采用三种不同的dsDNA投入量（25 ng、50 ng、100 ng）并相应调整PCR循环数；根据样本降解程度调整片段化时间；对高度降解样本省略双次尺寸筛选步骤以减少材料损失。随后，研究人员将选定的HC Custom方法应用于来自国家监测项目的35份临床样本的实施研究。所有样本的核酸提取均使用商业化试剂盒和自动化仪器完成，测序在Illumina平台（MiSeq或NextSeq）上进行，采用双端测序模式。生物信息学分析流程包括FastQC质量评估、fastp接头修剪和质量过滤、BWA-MEM比对至参考基因组MN996528.1、lofreq进行变异检测、bcftools生成一致性序列、Pilon进行一轮校正，并使用Nextclade和Pangolin进行谱系分类。

四、研究结果

2.1 比较研究

在比较研究中，S-MG方法的比对率最低（最高仅为0.35%），而两种富集方法的比对率显著更高（HC Commercial为46.9%–98.3%，HC Custom为78.5%–99.4%）。三种方法间差异具有统计学显著性（p = 0.006），但HC Custom与HC Commercial之间的配对比较无显著差异（p = 0.156）。在平均覆盖深度方面，S-MG范围为9×到932×，远低于两种杂交捕获方法（HC Commercial为508×–42,736×，HC Custom为2,771×–115,846×），差异具有统计学意义（p = 0.009）。在覆盖广度方面，三种方法间无显著差异（p = 0.1778）。通过覆盖图谱分析，HC Custom展现出最均匀的覆盖度。在所有方法中，仅S-MG处理的样本S2未能获得完整病毒基因组。模糊碱基（N）在S-MG处理的每个样本末端均有出现（2–335个），在HC Commercial处理的四个样本中出现（2–23个），而在HC Custom处理的样本中仅出现一次（10个）。在无歧义位置上，两种杂交捕获方法的一致性为100%。S-MG的平均比对质量值（mean mapq）最低（30.3–59.3），而两种杂交捕获方法均接近60。所有方法鉴定出的进化枝和Pango谱系完全一致。结果表明，HC Custom倾向于产生更高质量的序列，尽管与HC Commercial的差异不具统计显著性。

2.2 测试方法的实验室工作流程与实际方面比较

S-MG实验室协议耗时最短，但生物信息学分析更复杂且成本更高。HC Custom的总手动操作时间比HC Commercial多2–3小时，因为增加了额外的质量控制步骤。HC Custom在反转录后引入dsDNA质量控制节点，可作为后续步骤的起点并提高效率；它还通过倍增反转录反应体积来提高产量，并为不同DNA投入量进行了优化，对于高度降解样本还调整了片段化时间。HC Custom能够成功测序Ct值高达33.9的样本，而HC Commercial的成功上限为Ct 28。由于大量低质量临床样本的存在，尽管HC Custom所需手动时间更长，研究人员仍选择其用于实施研究。

2.3 定制化方法的实施研究

在实施研究中，研究人员使用HC Custom方法处理了35份来自水貂养殖场监测的样本。Ct值范围从17.6到33.9，高于此范围的样本测序失败。最低测试的平均样本片段大小为1153 bp，仍能获得高质量的全基因组序列。平均覆盖深度范围为335×到113,363×，覆盖广度范围为99.71%到100%。比对率中位数为95%，平均比对质量值中位数为60。值得注意的是，该方法成功从两份病毒RNA含量极低的样本（Ct值为33.5–33.9）中恢复了完整的SARS-CoV-2基因组，覆盖广度超过99.99%。相关性分析显示，Ct值与比对率和覆盖广度呈强负相关，与平均覆盖深度呈中等负相关。这些结果证实了HC Custom方法的高质量数据产出及其对SARS-CoV-2基因组监测的适用性，并确认其灵敏度优于HC Commercial。

五、讨论与结论总结

讨论部分指出，世界卫生组织（WHO）的测序建议强调高质量RNA的重要性，而本研究的出发点正是解决低质量材料的测序难题。S-MG方法因灵敏度低、成本高、易产生末端模糊碱基等问题，不适合常规诊断用途。相比之下，探针富集方法克服了扩增子方法需要不断重新设计引物、易受污染和偏差影响、难以覆盖基因组末端等缺点。虽然扩增子方法对高Ct值样本更灵敏，但水貂养殖场监测样本量远小于人类监测，允许在每个样本上投入更多资源。HC Custom方法成功测序了Ct值高于33的样本，证明了探针方法在低病毒样本中的有效性。研究认为，重叠探针设计提高了杂交效率和捕获能力。HC Custom方法的高比对率归因于更匹配的探针面板和高效的富集过程。尽管平均覆盖深度在不同样本间存在较大变异，但这并未影响序列数据的整体质量和变异株的正确鉴定。HC Custom使用的PCR循环数（8–10个）少于HC Commercial（19个），但在所有无歧义位置上获得的一致性序列完全相同，不过这可能影响低频变异检测能力。所有方法均能一致地鉴定出病毒变异株，并在波兰水貂养殖场中识别出8种不同的Pango谱系，其中绝大多数与水貂感染期间人类样本中流行的优势变异株相符。

研究结论部分翻译如下：

所有三种比较的方法均能产生适用于SARS-CoV-2变异株鉴定的高质量结果。其中，HC Custom的优势为其在标准实验室方案中的实施提供了支持。与S-MG方法相比，HC Custom表现出显著更高的灵敏度和更少的序列末端模糊碱基，同时保持了较低的成本。与HC Commercial方法相比，HC Custom倾向于产生更高质量的序列，但差异不具有统计显著性。然而，HC Custom比HC Commercial更灵敏。它允许根据样本数量和完整性调整文库制备过程，因此可用于低投入和降解的材料，如貂源样本。但它比HC Commercial需要更多时间，并且比S-MG需要更多的实际操作工作。定制化方法的另一个限制是无法对Ct值高于33.9的样本进行测序，并且研究人员未评估其检测低频变异的能力。据研究人员所知，这是首个比较不同SARS-CoV-2测序方法应用于水貂临床样本的研究。研究结果表明，单独评估每个样本并调整HTS方案参数可以提高SARS-CoV-2全基因组测序的性能。该研究为监测水貂中的SARS-CoV-2变异株提供了一个有用的工具，也可能有助于优化来自挑战性或降解样本（包括DNA病毒）的病毒测序。