整合单细胞与影像组学分析鉴定胶质母细胞瘤中与不良预后及免疫重塑相关的N-乙酰神经氨酸合酶（NANS）高表达特征

《International Journal of Molecular Sciences》：Integrative Single-Cell and Radiomics Analyses Identify N-Acetylneuraminate Synthase (NANS)-High Signature Associated with Adverse Prognosis and Immune Remodeling in Glioblastoma

胶质母细胞瘤（Glioblastoma, GBM）以显著异质性和免疫抑制微环境为特征。N-乙酰神经氨酸合酶（N-acetylneuraminate synthase, NANS）参与肿瘤相关代谢调控，但其与GBM及免疫谱的关系尚不明确。本研究旨在阐明NANS的预后及免疫相关性，并开发基于MRI影像组学的模型以无创预测NANS高表达GBM。研究人员在TCGA-GBM及两个CGGA队列中筛选预后相关基因，利用批量转录组和单细胞RNA测序分析评估NANS表达、患者生存关联及细胞定位，通过功能富集和CellChat分析表征NANS高表达骨髓来源巨噬细胞（bone marrow-derived macrophages, BMDMs），并在TCGA-GBM中验证NANS高表达BMDM特征与免疫浸润及配体-受体轴活性的关系，同时进行药物敏感性和CMap分析。研究人员从预处理后的T1对比增强及FLAIR图像中提取MRI影像组学特征，构建弹性网络逻辑回归模型以预测NANS高表达BMDM特征状态。结果显示，NANS被鉴定为GBM中与巨噬细胞相关的预后生物标志物，且在BMDMs中富集。NANS高表达BMDMs表现出mTORC1信号、氧化磷酸化、未折叠蛋白反应、糖酵解、缺氧及蛋白分泌程序富集。细胞间通讯分析显示其向恶性肿瘤状态和T细胞亚群的外向信号增强，其中LGALS9为中心的相互作用构成主要差异通讯程序。在TCGA-GBM中，NANS高表达BMDM特征与巨噬细胞浸润增加、广泛免疫浸润及LGALS9和PLAU轴评分升高相关。药物敏感性分析提示涉及PI3K/mTOR和MAPK/ERK通路的潜在治疗脆弱性。影像组学模型筛选出6个MRI特征，区分NANS高表达与低表达肿瘤的AUC为0.795（95% CI，0.652–0.939）；bootstrap验证平均AUC为0.793（95% CI，0.637–0.922）。NANS高表达BMDMs定义了GBM中预后不良且潜在可靶向的巨噬细胞相关表型。MRI影像组学可无创预测该NANS高表达BMDM状态，支持基于影像的风险分层和治疗选择。

胶质母细胞瘤（glioblastoma, GBM）是成人中枢神经系统中最致命的原发性恶性肿瘤，尽管采取最大安全切除、放疗和替莫唑胺化疗，患者生存率仍极低。治疗抵抗主要源于肿瘤深刻的生物学异质性，涉及遗传、表观遗传、发育及微环境程序。近年来单细胞转录组研究显示，恶性GBM细胞存在于多种可塑的细胞状态中，包括神经祖细胞样、少突胶质祖细胞样、星形胶质细胞样和间充质样程序。GBM免疫微环境以有限的效应淋巴细胞浸润和丰富的免疫抑制性髓系细胞为特征，肿瘤相关巨噬细胞和小胶质细胞构成主要免疫组分，参与免疫逃逸、血管生成、肿瘤进展及治疗抵抗。巨噬细胞谱系群体包括脑常驻小胶质细胞和募集的骨髓来源巨噬细胞（bone marrow-derived macrophages, BMDMs），二者在起源、转录特征和肿瘤生态系统中的功能角色上存在差异。鉴于免疫检查点阻断在GBM中临床获益有限，深入理解巨噬细胞异质性及巨噬细胞介导的肿瘤-免疫通讯，对于识别临床相关的免疫状态和治疗脆弱性至关重要。异常唾液酸化可通过Siglec-唾液酸信号调节肿瘤-免疫相互作用，促进免疫逃逸和抗肿瘤应答抑制。N-乙酰神经氨酸合酶（N-acetylneuraminate synthase, NANS）作为唾液酸从头生物合成的关键酶，可能参与肿瘤相关唾液酸化程序，但其在胶质瘤生态系统中的作用尚不明确。NANS是否标记独特的巨噬细胞相关状态，以及该状态是否与恶性细胞程序、T细胞亚群、免疫浸润和治疗脆弱性相关，尚未得到系统研究。单细胞RNA测序为解析候选生物标志物在GBM生态系统中的细胞定位和功能背景提供了有力手段，但转录组分析依赖组织样本，治疗前未必可获得。MRI是GBM诊断和管理的常规手段，影像组学可高通量提取定量成像特征，反映潜在肿瘤异质性。由于巨噬细胞状态受空间异质性肿瘤微环境（包括水肿、坏死和血管重塑）影响，影像组学可能为特定巨噬细胞相关分子表型提供无创替代指标。

研究人员整合多组学和影像组学，系统解析NANS在GBM肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）中的作用。首先在单细胞分辨率下描绘其细胞定位和细胞间通讯网络，随后在批量队列中确立其临床相关性和治疗意义，最终构建基于影像组学的成像生物标志物，实现对NANS相关特定免疫状态的无创患者分层。

研究主要采用以下关键技术方法：利用TCGA-GBM、CGGA mRNAseq_693和CGGA mRNAseq_325三个批量转录组队列进行预后基因筛选；整合Brain Immune Atlas和GBmap图谱来源的新诊断人GBM单细胞RNA测序数据，经Harmony批次校正后进行聚类和细胞注释；采用CellChat进行细胞间通讯推断；通过单样本基因集富集分析（single-sample gene set enrichment analysis, ssGSEA）评估免疫浸润；使用oncoPredict和CLUE/CMap进行药物敏感性和连接图谱分析；基于TCIA-GBM影像数据（40例具有匹配转录组数据的患者）提取T1对比增强和FLAIR图像的影像组学特征，经Wilcoxon检验和弹性网络逻辑回归构建预测模型。

2.1 NANS与不良预后相关且在BMDMs中高表达。研究人员在三个队列中鉴定出41个重叠预后基因，基于NANS在唾液酸生物合成中的作用及其与肿瘤免疫微环境的潜在相关性将其优先纳入研究。GEPIA分析显示GBM组织中NANS表达高于正常脑组织，TCGA-GBM中高NANS表达与显著更差的总生存期相关（p = 0.023）。分层分析显示，高NANS表达在IDH野生型GBM（HR = 1.53, 95% CI: 1.01–2.30; p = 0.042）和MGMT甲基化亚组（HR = 3.01, 95% CI: 1.43–6.36; p = 0.0024）中仍与较差总生存期相关。单细胞分析鉴定出五种主要细胞群体，NANS表达主要定位于巨噬细胞区室，且在BMDMs中显著富集，BMDMs中NANS检测细胞比例显著高于MG-TAMs（42.3% vs. 15.1%, p < 0.001）。

2.2 NANS高表达BMDMs以代谢激活和蛋白加工程序为特征。热图分析显示NANS高表达BMDMs中蛋白折叠、内质网应激、分泌和细胞应激适应相关基因（如MANF、HSPA5、LGALS3、HSP90B1、CALR、PDIA4和LGALS1）表达增加。基因本体（Gene Ontology, GO）富集分析显示上调基因主要涉及蛋白折叠、内质网应激反应、蛋白酶体介导的蛋白分解代谢、蛋白加工和内质网蛋白靶向。基因集富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA）显示NANS高表达BMDMs中mTORC1信号、氧化磷酸化、MYC靶点、未折叠蛋白反应、脂肪酸代谢、糖酵解、脂肪生成、上皮-间质转化、缺氧和蛋白分泌正富集，而炎症反应、TNFα经NF-κB信号、血红素代谢、KRAS信号和TGF-β信号负富集。

2.3 NANS高表达BMDMs与肿瘤和T细胞群体的CellChat推断通讯增强。恶性肿瘤细胞被分类为AC样、OPC样、MES样和NPC样状态，T细胞被注释为初始T、CD4⁺ T、CD8⁺ T和增殖T亚群。与NANS低表达BMDMs相比，NANS高表达BMDMs对T细胞亚群和恶性肿瘤状态的外向通讯强度更高，尤其朝向增殖T细胞、CD8⁺ T细胞和CD4⁺ T细胞。通路水平比较鉴定出CHEMERIN、PLAU、VISFATIN和ANGPT信号在NANS高表达BMDMs中优先富集。配体-受体分析显示LGALS9为中心的相互作用差异最大，包括LGALS9–CD45、LGALS9–CD44、LGALS9–P4HB和LGALS9–HAVCR2，涉及CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞、增殖T细胞和BMDMs。

2.4 NANS高表达BMDM特征的开发与表征。研究人员基于NANS高表达BMDMs富集基因构建特征，在TCGA-GBM中计算每个患者的特征评分并分为高、低分组。ssGSEA免疫浸润分析显示该特征评分与多种免疫细胞特征正相关，包括未成熟树突状细胞、调节性T细胞、肥大细胞、髓系来源抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells, MDSCs）、巨噬细胞和活化CD4⁺ T细胞。特征评分与MCP-counter单核细胞谱系丰度无显著相关（Spearman ρ = 0.074, p = 0.352），提示该特征捕获的是独特的巨噬细胞转录状态而非单纯反映巨噬细胞丰度。高分组中LGALS9和PLAU轴评分显著升高，而GAS6轴无显著差异。

2.5 药物敏感性分析揭示潜在治疗脆弱性。NANS高表达组对AZD8055、SCH772984、Trametinib、PD0325901、GNE-317、Buparlisib、Pictilisib、Dasatinib、Ribociclib和Selumetinib等化合物表现出预测性优先敏感。连接图谱分析鉴定出具有负归一化连接评分的药物作用机制类别，包括蛋白合成抑制剂、Na⁺/K⁺-ATPase抑制剂、exportin拮抗剂、IGF-1抑制剂、mTOR抑制剂、PI3K抑制剂和DNA抑制剂，提示NANS高表达BMDM相关表型可能与涉及mTOR/PI3K信号、MAPK/ERK信号、蛋白合成和细胞应激调节的预测性治疗脆弱性相关。

2.6 MRI影像组学实现NANS高表达BMDM状态的无创预测。研究人员利用40例具有匹配转录组衍生NANS-BMDM特征评分的GBM患者TCIA影像数据，从T1对比增强和FLAIR图像中提取2553个影像组学特征，经Wilcoxon检验保留309个候选特征，弹性网络建模进一步筛选出6个最终特征，包括GLDM_DependenceEntropy、Wavelet-LLL_Firstorder_Entropy、Wavelet-LLL_GLCM_ClusterTendency、Wavelet-LLL_GLCM_SumSquares、GLSZM_SAHGLE和GLSZM_SAE。这些特征主要捕获图像强度异质性、纹理复杂性和灰度空间组织。RadScore在NANS高表达肿瘤中显著高于低表达肿瘤（p = 0.00117），并与连续NANS-BMDM特征评分正相关（Spearman rho = 0.348, p = 0.0283）。模型区分NANS高表达与低表达肿瘤的AUC为0.795（95% CI: 0.652–0.939），bootstrap验证平均AUC为0.793（95% CI: 0.637–0.922）。

讨论部分指出，NANS并非仅仅是批量预后标志物，而是优先与GBM中特定巨噬细胞谱系区室相关，这一区分具有生物学重要性，因为GBM中肿瘤相关巨噬细胞并非均一群体。NANS高表达BMDMs的功能谱支持其代表一种活化和应激适应型巨噬细胞状态，mTORC1信号、氧化磷酸化、未折叠蛋白反应、糖酵解、缺氧和蛋白分泌的富集提示代谢和蛋白稳态需求增加。通讯谱提示该巨噬细胞状态可能占据免疫调节和重塑导向的微环境生态位，LGALS9为中心相互作用的优势尤为相关，因为LGALS9–HAVCR2/TIM-3轴已在多种肿瘤背景下与T细胞功能障碍、巨噬细胞极化和免疫逃逸相关。PLAU相关信号可能将NANS高表达BMDMs与细胞外基质重塑、侵袭、血管生成和肿瘤-基质相互作用联系起来。GBM中免疫富集并不一定代表有效的抗肿瘤免疫，NANS高表达特征与多种免疫细胞特征的正相关应被解读为免疫活跃但可能抑制性的微环境证据，这也可能解释NANS高表达特征与不良预后相关的原因。药物敏感性和CMap分析提供了额外转化假设，PI3K/mTOR和MAPK/ERK通路抑制剂在NANS高表达组中表现出预测性优先敏感，与观察到的代谢、蛋白加工和应激反应程序概念一致。影像组学组分将分子发现延伸至无创患者分层，MRI纹理和熵相关特征可能捕获巨噬细胞相关免疫和基质重塑的影像表现，但影像组学不应被解读为NANS表达或BMDM丰度的直接读数，而可能反映该免疫状态的更广泛组织水平后果。

研究结论为：本研究鉴定NANS高表达BMDMs为GBM中预后不良的巨噬细胞相关状态。该状态以代谢激活、应激反应和蛋白加工程序、与肿瘤和T细胞群体的增强通讯以及LGALS9/PLAU为中心的信号为特征。通过将该巨噬细胞状态与批量免疫特征、预测性治疗脆弱性和MRI影像组学联系起来，研究结果为整合单细胞免疫生物学与临床可及成像生物标志物提供了框架。未来实验和前瞻性验证对于确定NANS高表达BMDM表型能否指导GBM中巨噬细胞导向或免疫代谢治疗策略至关重要。