一线治疗期间应用紧凑型NGS液体活检面板对初诊转移性结直肠癌进行连续肿瘤不可知血浆分子分型研究

《International Journal of Molecular Sciences》：Serial Tumor-Agnostic Plasma Profiling with a Compact NGS Panel During First-Line Therapy for Newly Diagnosed Metastatic Colorectal Cancer

　　

摘要 血浆循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）分子分型可补充组织热点检测，并揭示转移性结直肠癌（metastatic colorectal cancer, mCRC）治疗期间的分子变化。研究人员前瞻性入组了39例初诊不可切除mCRC并接受一线治疗的患者。研究人员在治疗前及第2、4个周期后采集游离细胞DNA（cell-free DNA, cfDNA），并使用含分子条形码及错误校正的10 kb、10基因杂交捕获测序面板进行分析。在35例可评估患者中，32例（91.4%）检出基线致癌性变异。与针对共享RAS/BRAF靶点的常规组织PCR相比，在符合意向检测队列中，血浆检测的敏感性为84.2%（16/19），特异性为100%（19/19）；在技术可评估样本中，敏感性为88.2%（15/17），特异性为100%（17/17）。三个激活型KRAS变异（L19F、A59T和A146T）位于组织检测靶区之外；携带这些变异的患者接受了抗EGFR治疗。转移灶累及两个及以上器官的患者较单个转移部位的患者检出更多致癌性变异（中位数3对2；校正后q = 0.00184；秩双列相关系数 = 0.687）。连续采样显示9例患者中不同变异呈现分歧性轨迹。部分缓解患者早期血浆变异等位基因频率（variant allele frequency, VAF）降幅趋于更大，但经多重检验校正后与影像学缓解的关联未达统计学显著性。紧凑型肿瘤不可知血浆测序可提供互补性分子信息，但其临床效用仍需进一步验证。

转移性结直肠癌一线治疗期间应用紧凑型NGS液体活检面板进行连续肿瘤不可知血浆分子分型：前瞻性队列研究解读

一、研究背景与目的

转移性结直肠癌（metastatic colorectal cancer, mCRC）是一种分子高度异质性的疾病，分子检测是治疗方案制定的重要组成部分。KRAS和NRAS状态是考虑抗表皮生长因子受体（anti-epidermal growth factor receptor, anti-EGFR）治疗时的必要检测指标，BRAF V600E及错配修复状态同样对分子分型和治疗选择具有指导意义。组织检测仍是肿瘤基因分型的标准来源，但组织结果仅反映特定时间点取样病灶的情况，可能无法全面反映转移性疾病的分子多样性。

血浆循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）提供了一种微创、可重复采样的肿瘤相关分子信息来源。既往前瞻性研究已显示血浆检测可检出mCRC中的RAS突变，并与组织结果具有较高一致性。然而，血浆与组织结果可能存在不一致：低ctDNA释放可导致血浆假阴性，空间或时间异质性以及检测覆盖范围的差异也可能导致不一致。此外，血浆中检出的ctDNA量可能随转移负荷和疾病解剖分布而变化，这一变异性在解读阴性血浆结果及比较不同患者ctDNA谱时具有重要影响。连续采样可在一定程度上弥补单次测量的局限性，展示治疗期间循环分子信号的变化。

既往研究表明，mCRC全身治疗期间ctDNA的早期下降与后续治疗反应相关，纵向测序还可揭示不同变异在治疗期间的不同轨迹，包括持续存在、消失或新出现。然而，利用早期ctDNA动态指导治疗或预测反应仍处于研究阶段。一个紧凑型、肿瘤不可知的靶向面板可在无需依据患者肿瘤先期测序进行个体化设计的前提下，实现对结直肠癌复发突变基因的连续分析，并可能检出常规组织热点检测靶区之外的血浆变异。

基于上述背景，研究人员开展了一项前瞻性研究，评估一种紧凑型、错误校正、肿瘤不可知的靶向测序检测在初诊不可切除mCRC并接受一线全身治疗患者中的应用价值，包括基线血浆变异特征、与常规组织PCR在可评估RAS/BRAF靶点上的检测一致性、靶区覆盖范围之外的变异检出，以及治疗2个周期和4个周期后变异等位基因频率（variant allele frequency, VAF）的变化。

二、主要技术方法

本研究为单中心前瞻性队列研究，于俄罗斯莫斯科S.S. Yudin城市临床医院肿瘤中心一号开展，经当地伦理委员会批准（方案编号11.2025，批准日期2025年7月25日），共纳入2025年11月至2026年7月间39例经组织学确诊的结直肠腺癌患者。所有患者均接受一线全身治疗，治疗方案包括FOLFOX（14例）、化疗联合贝伐珠单抗（13例）及化疗联合抗EGFR药物（12例）。

研究人员在治疗前（p01）、2个周期后（p02）及4个周期后（p03，与计划首次影像学评估时间一致）采集外周血，共获得104份血浆样本。cfDNA提取后，使用含分子条形码的KAPA HyperPrep试剂盒构建测序文库，采用定制杂交捕获探针靶向结直肠癌中频繁突变的10个基因（KRAS、NRAS、BRAF、APC、TP53、PIK3CA、FBXW7、SMAD2、SMAD4、CTNNB1）约10 kb靶区域，在FASTASeq 300测序仪上进行PE150双端测序。生物信息学分析采用包含UMI一致性读段生成、比对、变异识别、过滤和功能注释的自动化流程，预设VAF报告阈值为≥0.15%，并要求至少5条替代一致性读段支持。统计方法包括Mann–Whitney U检验、Kruskal–Wallis检验、Wilson评分法计算诊断效能指标95%置信区间，以及Benjamini–Hochberg程序进行多重检验校正。

三、研究结果

3.1 患者队列与样本可用性

39例初诊不可切除IV期结直肠癌患者前瞻性入组，中位年龄66岁（四分位距[IQR]，59–70.5；范围，44–77），其中男性20例、女性19例。原发肿瘤位于乙状结肠14例、直肠14例。随访期间12例（30.8%）患者出现疾病进展，中位进展时间为5.4个月（IQR，4.1–6.4个月）。104份血浆样本中103份完成处理，1份因严重溶血排除；12份样本一致性读段覆盖度低于预设1000×阈值，仅从需要高测序深度的分析中排除。

3.2 基线血浆分子谱

35例患者基线样本测序覆盖度达标，其中32例（91.4%）检出致癌性变异，每位患者中位检出3个变异（IQR，2–3；范围，0–6），31例患者至少检出2个变异。最常受累基因为APC、TP53、KRAS和PIK3CA。基线cfDNA浓度中位数为12.2 ng/mL（IQR，7.3–22.0），最大VAF（maxVAF）中位数为11.1%（IQR，2.54–30.2%），聚合VAF（aggVAF）中位数为23.93%（IQR，5.70–69.15%）。

3.3 与原发肿瘤位置和转移负荷的关联

基线液体活检参数（cfDNA浓度、检出变异数、maxVAF、aggVAF）在原发肿瘤位置间无显著差异。单个转移部位的比较经Benjamini–Hochberg校正后均无统计学显著性。然而，转移器官数量与血浆检出变异数显著相关：转移累及两个及以上器官的患者较单个转移部位患者检出更多致癌性变异（中位数3对2；p = 0.00046；校正后q = 0.00184；秩双列相关系数 = 0.687，95% CI，0.422–0.891）。

3.4 血浆检测与常规组织PCR的比较

38例患者可获得匹配的组织PCR结果。三个组织检出的RAS变异未在对应基线血浆样本中检出：LB_UC11样本cfDNA提取量不足且覆盖度低；LB_UC26的NRAS G12C变异在p01缺失，但在p02和p03检出（VAF分别为1.52%和0.36%）。血浆测序还检出三个位于常规组织PCR检测靶区之外的KRAS变异（L19F、A59T和A146T），这些变异未纳入敏感性和特异性计算。在完整意向检测队列中，血浆检测对可评估RAS/BRAF靶点的敏感性为84.2%（16/19；95% CI，62.4–94.5%），特异性为100%（19/19；95% CI，83.2–100%），PPV为100%（16/16），NPV为86.4%（19/22）。在满足预设测序深度标准的34例患者中，敏感性为88.2%（15/17；95% CI，65.7–96.7%），特异性为100%（17/17；95% CI，81.6–100%）。

3.5 一线治疗期间血浆检出变异的纵向变化

33例患者具有可评估的基线和p02配对血浆谱。22例（66.7%）在两个时间点均检出致癌性变异，7例（21.2%）基线变异在p02未检出，4例两个时间点均未检出。总体上，VAF在2个周期治疗后普遍下降。LB_UC26和LB_UC38两例患者所有检出变异的VAF在p02均升高。p01至p03期间，9例患者（LB_UC07、LB_UC08、LB_UC12、LB_UC17、LB_UC19、LB_UC25、LB_UC26、LB_UC29和LB_UC41）观察到不同变异间的分歧性轨迹，包括部分变异持续或升高而同一患者其他变异下降或消失，以及变异在后续采样点新出现。

3.6 考虑手术患者的液体活检发现

首次影像学评估后，12例（30.8%）患者被认为适合手术。其中6例最后一次术前血浆样本未检出致癌性变异，3例maxVAF低于1%，其余3例maxVAF超过1%（LB_UC14在p02为2.6%，LB_UC21在p03为1.4%，LB_UC38在p03为9.4%）。手术组与非手术组间液体活检参数无显著差异。

3.7 血浆变异变化与RECIST影像学反应的关系

32例患者纳入探索性分析，其中13例部分缓解（PR）、13例疾病稳定（SD）、6例疾病进展（PD），无完全缓解。缓解者（PR）与非缓解者（SD+PD）在基线maxVAF（16.30%对7.09%，p = 0.397）和aggVAF（27.85%对15.63%，p = 0.611）上无显著差异。p02时缓解者maxVAF中位数为0.10%，非缓解者为1.03%（p = 0.093，q = 0.309）。从基线至p02，缓解者maxVAF中位百分比降幅为99.5%，非缓解者为87.8%；aggVAF相应降幅分别为99.7%和87.2%。这些差异呈缓解者降幅更大的趋势，但均未达统计学显著性（p = 0.123和p = 0.109，q = 0.309）。百分比变化较绝对变化更具区分性，但所有VAF动态比较经多重检验校正后均无统计学显著性。

四、讨论与结论

讨论部分总结

本研究证实了紧凑型肿瘤不可知血浆测序面板在多数基线测序覆盖度达标的mCRC患者中检出致癌性变异的能力，并识别出多个位于常规组织PCR检测靶区之外的KRAS变异。三个血浆KRAS变异（L19F、A59T和A146T）均已在实验细胞系模型中证实具有激活效应，OncoKB将其注释为结直肠癌中对西妥昔单抗和帕尼单抗耐药的R1级变异。携带这些变异的患者虽基于组织PCR阴性结果接受了抗EGFR治疗，但个体观察显示不同患者反应各异，不能据此建立因果关系，提示更广泛的血浆分型可能识别出额外具有潜在治疗相关性的变异。

基线血浆检出率（91.4%）与既往mCRC研究报道的76.8%至95.7%范围一致。由于未进行匹配白细胞DNA测序，克隆性造血来源的变异（尤其TP53）不能完全排除。治疗后VAF下降与既往前瞻性研究一致，探索性分析提示血浆变异水平变化可能比绝对水平更能反映治疗反应，但差异未达统计学显著性。9例患者中观察到同一患者内不同变异的分歧性轨迹，即使排除TP53变异后仍有4例，说明单一突变或聚合指标的变化可能无法完整描述患者血浆谱中所有变异的动态。基线时多器官转移患者检出更多变异，与疾病更广泛分布可能增加血浆可检出致癌性变异谱系的观点相符。手术候选患者中半数术前样本未检出变异，但液体活检指标在手术与非手术组间无显著差异。

研究结论翻译

在这项转移性结直肠癌患者的前瞻性队列研究中，一种紧凑型、肿瘤不可知、错误校正的血浆测序面板实现了一线治疗期间基线和连续cfDNA分析。除检出常规组织PCR覆盖的变异外，血浆测序还识别出位于PCR检测靶区之外的KRAS变异。纵向分析还揭示了不同变异间的分歧性轨迹，而多器官转移患者检出更多变异。这些发现支持进一步评估血浆分型作为组织检测补充手段的价值。需要更大规模、包含全面组织和白细胞对照比较、分析验证及临床结局评估的研究来确定其临床有效性和实用性。