《International Journal of Molecular Sciences》：Genetically Predicted Blood DNA Methylation Reveals Putative Regulatory Signals Associated with ALS Risk
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血浆循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）分析可能补充组织热点检测，并揭示转移性结直肠癌（metastatic colorectal cancer，mCRC）治疗期间的分子变化。研究人员前瞻性研究了39例新诊断不可切除mCRC
血浆循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）分析可能补充组织热点检测，并揭示转移性结直肠癌（metastatic colorectal cancer，mCRC）治疗期间的分子变化。研究人员前瞻性研究了39例新诊断不可切除mCRC并接受一线治疗的患者。在治疗前及第2、4周期后采集游离DNA（cell-free DNA，cfDNA），并使用带有分子条形码和错误校正的10 kb、10基因杂交捕获测序panel进行分析。35例可评估患者中有32例（91.4%）检测到基线致癌变异。与常规组织PCR检测共有RAS/BRAF靶点相比，在意向检测队列中，血浆检测的敏感性为84.2%（16/19），特异性为100%（19/19）；在技术可评估样本中，敏感性为88.2%（15/17），特异性为100%（17/17）。三个激活型KRAS变异（L19F、A59T和A146T）位于组织检测靶区之外；携带这些变异的患者接受了抗EGFR治疗。转移灶累及两个及以上器官的患者比单个转移部位的患者检出更多致癌变异（中位数，3对2；校正后q = 0.00184；秩双列相关 = 0.687）。连续采样揭示了9例患者中个体变异的不同演变轨迹。部分缓解患者中血浆变异等位基因频率（variant allele frequency，VAF）的早期下降幅度趋于更大，但经多重检验校正后，与影像学缓解的关联未达到统计学显著。紧凑型肿瘤非依赖性血浆测序提供了互补的分子信息，但其临床实用性仍需进一步验证。
论文解读文章
一、研究背景与目的
转移性结直肠癌（metastatic colorectal cancer，mCRC）是一种分子异质性较强的疾病，分子检测是治疗规划的重要组成部分。KRAS和NRAS状态是考虑抗表皮生长因子受体（anti-epidermal growth factor receptor，anti-EGFR）治疗时的必要条件，BRAF V600E和错配修复状态也影响分子分型和治疗选择。组织活检是肿瘤基因分型的标准来源，但组织结果仅反映特定时间点取样病灶的情况，可能无法全面反映转移性疾病的分子多样性。血浆循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）提供了一种微创、可重复采样的肿瘤相关分子信息来源。既往研究显示，血浆检测可检测mCRC中的RAS突变，并与组织结果具有较好的一致性。然而，血浆与组织结果可能存在不一致：低ctDNA释放可导致血浆检测假阴性，空间或时间异质性以及检测覆盖范围的差异也可能造成不一致。此外，ctDNA水平可能随转移负荷和疾病解剖分布而变化，这对解读阴性血浆结果和比较患者间ctDNA图谱具有重要意义。连续采样可在一定程度上弥补单次测量的局限性，反映治疗期间循环分子信号的变化。在mCRC中，全身治疗期间ctDNA的早期下降与后续治疗反应相关。除整体ctDNA负荷的变化外，纵向测序可揭示个体变异的不同轨迹，包括持续存在、消失或治疗期间新出现。这些差异可能反映转移性疾病的分子异质性和治疗相关的肿瘤亚克隆变化。然而，利用早期ctDNA动态指导治疗或预测反应仍处于研究阶段，而非成熟的常规应用。基于此，研究人员开展了一项前瞻性研究，评估一种紧凑型、肿瘤非依赖性、带错误校正的靶向测序检测在初诊不可切除mCRC患者一线治疗中的应用价值。
二、研究设计与方法概述
该研究为单中心前瞻性研究，在俄罗斯莫斯科S.S. Yudin城市临床医院肿瘤中心1号开展，经当地伦理委员会批准（方案编号11.2025，批准日期2025年7月25日），遵循赫尔辛基宣言。研究纳入39例新诊断、不可切除的临床IV期结直肠癌（mCRC）成年患者，接受一线全身治疗。排除标准包括既往治疗、多原发恶性肿瘤及5年内诊断的其他恶性肿瘤。入组为非随机连续入组，不干预常规诊疗。实验室人员对患者临床和病理数据设盲，血浆检测结果不提供给治疗医师，不影响临床管理。研究采用的关键技术方法包括：常规FFPE组织PCR检测（KRAS、NRAS、BRAF热点突变）；血浆cfDNA提取与定量；基于KAPA HyperPrep试剂盒和定制杂交捕获探针的靶向NGS文库构建，panel覆盖约10 kb、10个结直肠癌相关基因（KRAS、NRAS、BRAF、APC、TP53、PIK3CA、FBXW7、SMAD2、SMAD4、CTNNB1）；使用UMI分子条形码进行错误校正；FASTASeq 300测序仪PE150双端测序；生物信息学流程包括fastp质控、fgbio生成一致性读段、BWA比对至hg38、LoFreq变异调用，报告阈值为VAF≥0.15%且至少5条替代一致性读段支持；VEP功能注释及OncoKB、gnomAD等数据库注释。血液样本在治疗前（p01）、第2周期后（p02）和第4周期后（p03，即首次影像学评估时）采集，共104份血浆样本。
三、研究结果
2.1 患者队列与样本可用性
共入组39例新诊断不可切除IV期结直肠癌患者，中位年龄66岁（IQR 59–70.5），男性20例、女性19例。原发肿瘤位于乙状结肠14例、直肠14例。所有患者接受一线全身治疗：14例接受FOLFOX方案，13例接受化疗联合贝伐珠单抗，12例接受化疗联合抗EGFR药物。随访期间，12例（30.8%）患者出现疾病进展，中位进展时间为5.4个月（IQR 4.1–6.4）。104份血浆样本中103份完成处理，1份因严重溶血排除；12份样本一致性读段覆盖度低于预设1000×阈值，仅从需要高覆盖度测序的分析中排除。
2.2 基线血浆分子图谱
基线时，35例患者的一致性读段覆盖度高于预设阈值，其中32例（91.4%）检测到致癌变异。每例患者中位检出3个变异（IQR 2–3），31例患者至少检出2个变异。最常受影响的基因为APC、TP53、KRAS和PIK3CA。基线血浆cfDNA浓度中位数为12.2 ng/mL（IQR 7.3–22.0），最大VAF（maxVAF）中位数为11.1%（IQR 2.54–30.2%），聚合VAF（aggVAF）中位数为23.93%（IQR 5.70–69.15%）。
2.3 与原发肿瘤位置和转移负荷的关联
基线血浆参数（cfDNA浓度、检出变异数、maxVAF、aggVAF）在原发肿瘤位置间无显著差异。单个转移部位的比较经Benjamini–Hochberg校正后均无统计学显著差异。相比之下，转移部位数量与血浆检出变异数相关：转移累及两个及以上器官的患者比单个转移部位患者检出更多致癌变异（中位数3对2；p = 0.00046；校正后q = 0.00184；秩双列相关 = 0.687，95% CI 0.422–0.891）。其他血浆参数在两组间无显著差异。
2.4 血浆检测与常规组织PCR的比较
38例患者有匹配的组织PCR结果。三个组织检出的RAS变异未在对应基线血浆样本中检出：LB_UC11血浆样本cfDNA提取量不足且覆盖度低；LB_UC26的NRAS G12C变异在p01时未检出，但在p02和p03时检出（VAF分别为1.52%和0.36%）。血浆测序还检出3个位于常规组织PCR靶区之外的KRAS变异：KRAS L19F、A59T和A146T，均为激活型突变。这3个变异未纳入敏感性和特异性计算，因为对照PCR检测未覆盖这些位点。在意向检测队列中，血浆检测对可评估的RAS/BRAF靶点的敏感性为84.2%（16/19；95% CI 62.4–94.5%），特异性为100%（19/19；95% CI 83.2–100%），PPV为100%（16/16），NPV为86.4%（19/22）。在满足预设测序深度标准（≥1000×）的34例患者中，敏感性为88.2%（15/17；95% CI 65.7–96.7%），特异性为100%（17/17；95% CI 81.6–100%），PPV为100%（15/15），NPV为89.5%（17/19）。
2.5 一线治疗期间血浆检出变异的纵向变化
p02时，33例患者有配对基线和两周期后血浆图谱且覆盖度满足评估要求。22例（66.7%）在两个时间点均检出致癌变异，7例（21.2%）基线变异在p02未检出，4例两个时间点均未检出。整体上，VAF在治疗两周期后普遍下降。LB_UC26和LB_UC38两例患者所有检出变异的VAF在p02时均升高。其他患者中，同一血浆图谱内不同变异的改变方向可能不同。在p01–p03期间，9例患者（LB_UC07、LB_UC08、LB_UC12、LB_UC17、LB_UC19、LB_UC25、LB_UC26、LB_UC29和LB_UC41）观察到个体变异的发散轨迹，包括部分变异持续或升高而其他变异下降或不可检出，以及变异在后续采样点新检出。
2.6 考虑手术患者的血浆检测结果
首次影像学评估后，12例（30.8%）患者被认为适合手术。其中6例最近一次术前血浆样本未检出致癌变异，3例maxVAF低于1%，其余3例maxVAF超过1%（LB_UC14在p02为2.6%，LB_UC21在p03为1.4%，LB_UC38在p03为9.4%）。手术组与非手术组之间的maxVAF、aggVAF及其他血浆参数无统计学显著差异。
2.7 血浆变异变化与RECIST影像学反应的关联
排除治疗方案更改的4例患者和缺乏反应数据的患者后，32例患者纳入分析。首次影像学评估时最佳反应为：部分缓解（PR）13例、疾病稳定（SD）13例、疾病进展（PD）6例，无完全缓解（CR）。将PR定义为应答者、SD和PD定义为非应答者。基线时两组maxVAF和aggVAF无显著差异。p02时，非应答者的两个指标趋于更高，但未达统计学显著。应答者在p02时maxVAF和aggVAF的中位百分比降幅更大（99.5%对87.8%；99.7%对87.2%），但差异未达统计学显著（p = 0.123和p = 0.109，q = 0.309）。总体上，百分比变化比绝对变化更具区分性，但所有VAF动态比较经多重检验校正后均未达统计学显著。
四、讨论与结论
该研究证实，一种紧凑型肿瘤非依赖性血浆测序panel可在大多数具有足够基线测序覆盖度的mCRC患者中检出致癌变异，并识别出位于常规组织PCR靶区之外的KRAS变异。血浆检测对可评估的RAS/BRAF靶点与组织PCR相比具有较高的敏感性和100%的特异性，但置信区间较宽，反映可评估病例数较少。三个额外的血浆KRAS变异位于常规组织PCR靶区之外，并非该检测的分析假阴性，而是说明覆盖额外区域的panel可提供预设热点检测无法提供的信息。携带KRAS L19F和A59T的患者基于组织PCR阴性结果接受了抗EGFR治疗，但后续出现疾病进展；携带KRAS A146T的患者在抗EGFR治疗期间达到PR。这些个体观察不能确立因果关系，但提示更广泛的血浆分析可能识别额外的治疗相关变异。由于未进行匹配白细胞测序，无法完全排除克隆性造血来源的变异，尤其是TP53变异。基线血浆检出率（91.4%）与既往研究报道的76.8%–95.7%范围一致。治疗两周期后多数患者VAF下降，与既往研究中早期ctDNA下降与治疗反应相关的发现一致。探索性分析提示血浆变异水平的变化可能比绝对水平更能反映治疗反应，但差异未达统计学显著。同一患者内不同变异可呈现发散轨迹，说明单一突变或聚合指标的变化可能无法描述患者血浆图谱中的每个变异。转移累及多器官患者检出更多变异，与疾病分布更广可能增加血浆中可检出致癌变异谱的观点一致。手术组与非手术组血浆参数无显著差异，该探索性比较不应解读为血浆检测可识别可切除性转化。研究存在多项局限性：单中心39例患者、治疗方案异质、组织对照为常规热点PCR而非全面组织NGS、未进行匹配白细胞测序或独立正交验证、非正式分析验证研究、检验效能不足以评估血浆变异变化与临床结局的关联。总体而言，这些结果支持使用紧凑型肿瘤非依赖性panel进行连续血浆分析的可行性，表明血浆分析可提供常规组织PCR未覆盖的分子信息，纵向数据也显示同一患者的不同变异在治疗期间可能遵循不同轨迹。需要更大规模的前瞻性研究，结合全面的配对组织和血浆分析、匹配白细胞测序、预设分子反应标准和临床结局评估，来确定该方法的分析和临床实用性。
五、结论翻译
在这项转移性结直肠癌患者的前瞻性队列研究中，一种紧凑型、肿瘤非依赖性、带错误校正的血浆测序panel能够在一线治疗期间进行基线和连续的cfDNA分析。除检测到常规组织PCR覆盖的变异外，血浆测序还识别出位于PCR检测靶区之外的KRAS变异。纵向分析还揭示了个体变异的不同轨迹，而转移累及多器官的患者检出更多变异。这些发现支持进一步评估血浆分析作为组织检测补充手段的价值。需要更大规模的研究，结合全面的组织和白细胞比较、分析验证和临床结局评估，来确定其临床有效性和实用性。
