基于高通量蛋白质组学鉴定早期结直肠癌新型血浆蛋白标志物

《International Journal of Molecular Sciences》：Identification of Novel Plasma Protein Biomarkers for Early Clinical Stage Colorectal Carcinoma by High-Throughput Proteomics

专业摘要翻译 早期检测对于提高结直肠癌（colorectal carcinoma, CRC）患者的生存率至关重要，这凸显了对可靠早期阶段生物标志物的需求。血浆蛋白生物标志物可能有助于早期CRC的检测。在本研究中，研究人员对24例I–III期CRC患者和10例非肿瘤参与者的血浆进行了蛋白质组学分析，同时分析了来自CRC患者的配对肿瘤组织和远端正常组织，以识别在I期疾病中优先升高的蛋白质。七种血浆蛋白在I期CRC中的丰度高于II期和III期CRC以及非肿瘤参与者；其中三种蛋白——HSPA8、ALDOA和PDLIM1——在I期肿瘤组织中也升高。在I期CRC与非肿瘤参与者的发现比较中，单独使用HSPA8的内部交叉验证随机森林分类准确率达到88.9%，与三蛋白模型相当。组织水平的上调进一步得到了Western blotting的支持。酶联免疫吸附试验（ELISA）评估纳入了32名具有匹配蛋白质组学测量的参与者，随后扩展至108名参与者。HSPA8评分通过将稀释校正后的HSPA8浓度除以10 μL血浆中的总蛋白量计算得出。在扩展队列中，使用该评分的随机森林分类对I期CRC对比II–IV期CRC实现了74.47%的内部交叉验证准确率，对I期CRC对比非肿瘤参与者则为56.67%。相应的探索性参考截断值分别为0.066和0.029。这些发现将HSPA8确定为一种用于检测I期CRC的潜在血浆蛋白生物标志物。

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一、研究背景与目的

结直肠癌（colorectal carcinoma, CRC）是全球主要的恶性肿瘤之一，其预后高度依赖于诊断时的临床分期。尽管分子靶向治疗改善了部分转移性CRC患者的结局，但治疗效果仍存在异质性。因此，开发可靠、微创的生物标志物用于早期检测和疾病监测具有重要的临床意义。液体活检技术及循环分子标志物为此提供了新的方向。血浆蛋白质组中含有组织来源的蛋白，是疾病检测和监测的潜在生物标志物来源。然而，现有研究多关注于未来CRC风险的关联，而非针对已存在的I期疾病的诊断性能。此外，血浆蛋白浓度的宽动态范围限制了低丰度蛋白的检测。本研究旨在整合分期分层的血浆蛋白质组学与配对肿瘤及远端正常组织分析，以识别在I期CRC中优先升高的蛋白质，并通过扩大队列进行验证。

二、研究方法概述

研究人员建立了一个临床样本库，纳入来自天津市人民医院（天津，中国）接受CRC手术的患者。血浆蛋白质组学分析包括24例CRC患者（I–III期各亚组）和10例非肿瘤参与者；组织蛋白质组学则分析了24对配对肿瘤及远端正常组织标本，以及4例非肿瘤肠道标本。ELISA评估扩展至108名参与者（94例CRC患者和14例非肿瘤参与者）。关键技术方法包括：采用白蛋白去除试剂盒降低血浆中高丰度蛋白干扰后进行过滤辅助样品制备（FASP）和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析；使用Proteome Discoverer软件结合UniProt数据库进行蛋白鉴定；通过Wilcoxon检验和倍数变化筛选差异蛋白；利用Metascape进行通路富集分析；采用Weka软件进行随机森林分类和内部交叉验证；使用商业ELISA试剂盒测量血浆HSPA8浓度并计算HSPA8评分；利用公共ChIP-seq数据分析组蛋白修饰状态。

三、研究结果

2.1 血浆蛋白质组学总体概况

研究人员在血浆中共检测到884种蛋白。以p < 0.05且倍数变化 > 1.5为标准，分别鉴定出30种、60种和98种在I期CRC中相对于II期、III期CRC及非肿瘤参与者丰度升高的蛋白。其中7种蛋白在所有三个比较组中均升高，被选作后续组织水平评估的候选蛋白。

2.2 血浆蛋白与组织蛋白的关系

组织蛋白质组学共检测到8451种蛋白。在7种血浆候选蛋白中，ALDOA、PDLIM1和HSPA8在I期肿瘤组织中的丰度显著高于配对的远端正常组织。这三个蛋白的肿瘤-正常丰度比值在I期CRC中也高于II期和III期CRC，表明其组织与血浆水平的升高趋势一致。

2.3 探索性分类优先选择HSPA8进行ELISA评估

利用血浆质谱丰度数据，对ALDOA、PDLIM1和HSPA8进行单蛋白及组合的随机森林分类（I期CRC vs. 非肿瘤参与者）。三蛋白模型准确率为88.9%，而单独HSPA8即达到相同准确率（88.9%），因此被优先选择进行ELISA验证。在32名匹配参与者中，HSPA8评分（稀释校正后浓度/10 μL血浆总蛋白量）与质谱丰度呈中等程度正相关（Spearman’s ρ = 0.45, p = 0.0080）。在匹配子集中，HSPA8评分在I期CRC中显著高于非肿瘤参与者。在扩展至108人的队列中，I期CRC的HSPA8评分显著高于II期、IV期CRC及非肿瘤参与者。内部交叉验证显示，I期 vs. II–IV期CRC的分类准确率为74.47%（敏感性25.00%，特异性84.62%）；I期 vs. 非肿瘤参与者的准确率为56.67%（敏感性62.50%，特异性50.00%）。探索性参考截断值分别为0.066和0.029。

2.4 激活型组蛋白修饰可能促进早期CRC患者HSPA8上调

Western blotting证实HSPA8在I期肿瘤组织中的丰度显著高于II期、III期肿瘤组织及正常组织。公共TCGA转录组数据显示，HSPA8在结肠腺癌和直肠腺癌组织中的转录水平显著高于正常组织。公共ChIP-seq数据显示，在CRC细胞系（如HCT116）中，HSPA8基因座存在较强的H3K4me3信号，而在非恶性结肠上皮细胞系NCM460中较弱；其他激活型组蛋白修饰（如H3K27ac、H3K4ac）也存在，而抑制型修饰H3K27me3信号较弱。这些模式表明HSPA8的上调可能与激活型组蛋白修饰，特别是H3K4me3有关。

2.5 HSPA8相关的临床特征

TCGA泛癌RNA-seq数据分析显示，HSPA8在多种肿瘤（包括结肠腺癌和直肠腺癌）中过表达。生存分析表明，HSPA8高表达的CRC患者预后更好，提示高HSPA8表达可能预示恶性程度较低的早期CRC。

四、讨论与结论

讨论部分总结： 本研究将分期分层的血浆蛋白质组学与肿瘤及配对正常组织分析相结合，识别出在I期CRC中优先升高的蛋白候选物。HSPA8作为分子伴侣，参与蛋白质稳态维持，并在多种癌症中被研究。本研究发现HSPA8在I期CRC的血浆和组织中均升高，且与激活型组蛋白修饰相关。与既往报道的CRC蛋白标志物相比，本研究聚焦于I期这一特定阶段，并通过直接与晚期CRC及非肿瘤人群的比较，突出了HSPA8的潜在价值。然而，其在区分非肿瘤参与者时的特异性及对晚期CRC的敏感性仍有待提高。

结论部分翻译： 我们收集了I–III期CRC患者的肿瘤和配对正常组织，以及匹配的血浆样本和非肿瘤参与者的血浆。我们将高通量蛋白质组学分析与患者内肿瘤和正常组织蛋白丰度的比较、I期血浆差异蛋白的鉴定以及机器学习分类相结合。七种血浆蛋白在I期CRC中相对于II期、III期CRC及非肿瘤参与者升高；其中三种蛋白（HSPA8、ALDOA和PDLIM1）在I期肿瘤中也升高。在发现比较中，单独使用HSPA8达到了与三蛋白模型相同的分类准确率。公共ChIP-seq数据暗示激活型组蛋白修饰可能促进了HSPA8的上调。为了评估其临床转化潜力，我们通过ELISA测量了HSPA8，并将其浓度标准化为10 μL血浆中的总蛋白量，得到HSPA8评分。I期CRC的评分显著高于II期、IV期CRC及非肿瘤参与者。评分也高于III期CRC，但差异无统计学意义。在108名参与者的扩展队列中，使用HSPA8评分的内部交叉验证随机森林分类对I期 vs. II–IV期CRC的准确率为74.47%，对I期 vs. 非肿瘤参与者的准确率为56.67%。相应的探索性参考截断值分别为0.066和0.029。对晚期CRC的敏感性和特异性分别为25.00%和84.62%，对非肿瘤参与者则为62.50%和50.00%。这些发现将HSPA8确定为早期CRC检测的候选标志物。在临床应用前，需要在更大规模、独立的多个心队列中使用标准化检测方法和预设阈值进行验证。