《International Journal of Molecular Sciences》：Evaluation of the Anticancer Potential of Compound 107 via the VEGFA and VEGFR2 (KDR) Signaling Pathway in Colorectal Cancer: Integrative Analysis of Clinical, In Silico, and In Vitro Approaches
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VEGFA与VEGFR2/KDR信号通路是肿瘤血管生成和结直肠癌（colorectal cancer, CRC）进展的主要调控因子。本研究采用临床、体外和计算机模拟（in silico）相结合的整合方法，研究了化合物107的抗癌作用。研究人员在配对的大肠癌肿瘤
VEGFA与VEGFR2/KDR信号通路是肿瘤血管生成和结直肠癌（colorectal cancer, CRC）进展的主要调控因子。本研究采用临床、体外和计算机模拟（in silico）相结合的整合方法，研究了化合物107的抗癌作用。研究人员在配对的大肠癌肿瘤组织和邻近非肿瘤组织中评估了VEGFA和KDR的表达，同时进行了分子对接和ADMET分析以表征化合物107。在HT-29细胞中评估了其对细胞活力、凋亡、细胞周期分布、VEGFA/KDR基因表达以及VEGFA和VEGFR2蛋白水平的影响。VEGFA和KDR在CRC组织中的表达分别显著升高1.98倍和2.02倍（均p < 0.001），并伴随蛋白免疫反应性增加（均p < 0.0001）。化合物107对VEGFA（?8.60 kcal/mol）和VEGFR2（?8.30 kcal/mol）显示出良好的预测结合能力，尽管ADMET分析提示其存在与药代动力学和毒性特征相关的局限性。化合物107以浓度和时间依赖性方式降低MTT法检测的代谢活力，增加早期凋亡，减少G0/G1期细胞群，并增加S期细胞群。此外，治疗后VEGFA和KDR基因表达及相应蛋白荧光强度显著降低。总之，化合物107降低了HT-29细胞的代谢活力并增加了早期凋亡，同时伴随VEGFA和KDR表达的降低。这些发现提示化合物107的细胞效应与VEGFA/VEGFR2相关分子标志物的变化之间存在关联；然而，研究结果并未证明对VEGFA/VEGFR2信号通路的直接抑制。需要进一步的机制研究来阐明这种关系。
结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是一种以细胞增殖、侵袭、转移及肿瘤微环境改变为特征的复杂恶性肿瘤，新生血管形成对其生长和转移至关重要。血管内皮生长因子（VEGF）家族是血管生成的关键调控因子，其中VEGFA通过其受体VEGFR2（由KDR基因编码）发挥主要生物学效应。既往研究已表明VEGFA/VEGFR2轴在CRC血管生成、肿瘤微环境调控及增殖存活中发挥核心作用，且多组学和单细胞测序研究揭示了该通路在CRC中的重要性。然而，抗血管生成治疗的临床应答存在个体差异，缺乏可靠的预测性生物标志物，且肿瘤血管异质性和耐药机制凸显了探索靶向VEGF/VEGFR信号的新型分子的必要性。化合物107是一种含偶氮甲碱（–CH=N–）/Schiff碱结构的合成化合物，此前研究显示该类化合物可降低癌细胞活力并改变Wnt/MAPK信号相关基因表达，但其对CRC细胞中VEGFA/VEGFR2通路的影响尚不清楚。为此，研究人员整合临床组织样本、体外细胞实验和计算机模拟方法，系统评估了化合物107对VEGFA和VEGFR2/KDR信号通路相关标志物的影响。
研究人员首先对32例CRC患者的配对肿瘤及癌旁非肿瘤组织进行了VEGFA和KDR基因表达及免疫组化检测，随后利用分子对接和ADMET预测表征化合物107与VEGFA、VEGFR2的结合特征及药代毒性属性，并在HT-29细胞中通过MTT实验、流式细胞术（细胞周期和Annexin V凋亡检测）、RT-qPCR和免疫荧光实验评估其抗肿瘤效应。研究结果表明，化合物107以浓度和时间依赖性方式降低HT-29细胞代谢活力，增加早期凋亡，改变细胞周期分布，并显著下调VEGFA和KDR的基因及蛋白表达水平。分子对接显示化合物107与VEGFA（?8.60 kcal/mol）和VEGFR2（?8.30 kcal/mol）具有较好的预测结合能，但ADMET分析提示其存在分子量过高、胃肠道吸收低、潜在肝毒性及AMES致突变风险等局限性。该研究为化合物107在CRC中通过调控VEGFA/VEGFR2相关分子标志物发挥抗癌作用提供了初步证据，但未能证明其直接抑制该信号通路，需进一步机制研究加以验证。
本研究采用的主要关键技术方法包括：①临床配对组织样本的RT-qPCR和免疫组化（IHC）分析，样本来自32例CRC患者的肿瘤及配对的癌旁非肿瘤组织；②AutoDock Vina分子对接模拟，评估化合物107与VEGFA（PDB ID: 3QTK）和VEGFR2（PDB ID: 2QU5）的相互作用；③ADMETlab 2.0平台进行ADMET预测；④HT-29细胞模型（ATCC HTB-38）中的MTT活力检测、Muse细胞周期分析、Muse Annexin V凋亡检测、RT-qPCR和免疫荧光染色及ImageJ定量分析。以上方法整合了临床、计算和实验三个层面，系统评估了化合物107的抗癌潜力。
**1. 患者人口统计学分析**：研究纳入32例CRC患者，平均年龄64.78 ± 9.73岁，男性占65.6%，直肠乙状结肠为最常见肿瘤部位（37.5%），大多数肿瘤为Grade 2级（65.6%）。该分析明确了临床样本的基本特征。
**2. 组织VEGFA和KDR表达**：通过配对t检验分析RT-qPCR数据发现，肿瘤组织中VEGFA表达较配对癌旁非肿瘤组织升高1.98倍（p < 0.001），KDR表达升高2.02倍（p < 0.001），证实CRC组织中VEGFA和KDR基因表达显著上调。
**3. 与组织学和临床特征的关联**：Kruskal-Wallis检验和Mann-Whitney U检验显示，VEGFA和KDR的肿瘤-对照ΔCt差异在不同组织学分级、新辅助治疗状态、肿瘤定位及多种临床特征（糖尿病、高血压、吸烟等）间均无显著差异（均p > 0.05），提示这些基因表达变化与所评估的临床病理参数无明显关联。
**4. VEGFA与KDR的相关性**：Spearman相关分析显示，VEGFA和KDR的肿瘤-对照ΔCt差异呈显著正相关（ρ = 0.358, p = 0.044），表明两个基因的表达变化方向一致。
**5. 组织病理学发现**：H&E染色显示，癌旁非肿瘤组织保留正常黏膜结构和管状隐窝，而CRC腺癌组织表现出腺体结构破坏、浸润性生长、促结缔组织增生性间质和炎细胞浸润等典型恶性特征，为后续分子分析提供了形态学基础。
**6. 免疫组化发现**：ImageJ半定量分析显示，CRC组织中VEGFA和VEGFR2的积分光密度（IOD）均显著高于配对癌旁非肿瘤组织（均p < 0.0001），从蛋白水平进一步验证了VEGFA和VEGFR2在CRC中的上调。
**7. 计算机ADMET和类药物结果**：ADMETlab 2.0预测显示，化合物107分子量为593.19 g/mol（超过Lipinski规则阈值），TPSA较高（>140 ?2），预测肠吸收概率低（HIA = 0.00），Caco-2通透性为?5.387，且具有较高的hERG阻断（0.796）、肝毒性（0.81）和AMES致突变（0.999）预测风险。这些结果提示化合物107存在潜在的药代和安全问题，但仅作为初步预测，需实验验证。
**8. 分子对接相互作用分析**：AutoDock Vina对接显示，化合物107与VEGFA的结合能为?8.60 kcal/mol，与VEGFR2为?8.30 kcal/mol，略优于参考药物多西他赛（DTX）（分别为?8.30和?8.00 kcal/mol）。化合物107与两种靶蛋白形成了更密集的氢键、π-阳离子、π-烷基等相互作用网络，RMSD值在1.50-1.80 ?之间。这些结果仅提供结构假设，不构成靶点结合的直接证据。
**9. 细胞培养研究结果**：
**9.1 MTT代谢活力结果**：化合物107和DTX均呈浓度和时间依赖性降低HT-29细胞代谢活力。化合物107在24、48和72小时的IC50分别为32.91、19.96和17.51 μg/mL，均低于DTX（>80.79、61.26和37.86 μg/mL），表明在实验条件下化合物107以较低浓度即可使HT-29细胞代谢活力降低50%。
**9.2 HT29细胞组中的表达**：RT-qPCR分析显示，与对照组相比，DTX和化合物107处理均显著降低VEGFA和KDR的相对表达（化合物107组VEGFA为0.75倍，KDR为0.74倍；DTX组分别为0.53倍和0.24倍；均p < 0.0001）。
**9.3 细胞周期分析**：流式细胞术显示，化合物107组G0/G1期细胞显著低于对照组（p = 0.0012），S期细胞显著升高（p = 0.0176），而DTX组未引起显著的G2/M期变化。
**9.4 Annexin V结合实验**：化合物107和DTX处理后，活细胞比例显著降低，早期和晚期凋亡细胞比例均显著增加（均p < 0.0001），表明化合物107具有促凋亡作用。
**9.5 VEGFA和VEGFR2免疫荧光分析**：CTCF定量分析显示，化合物107和DTX处理后VEGFA（p = 0.0043）和VEGFR2（p = 0.0011）荧光强度均显著低于对照组（均p < 0.01），两种化合物之间无显著差异，从蛋白水平证实了处理对VEGFA和VEGFR2的下调。
**讨论与结论**：讨论部分指出，VEGFA和KDR在CRC组织中的共上调与现有关于VEGF/VEGFR轴在CRC血管生成和肿瘤微环境调控中的核心作用一致。化合物107通过降低细胞活力、诱导早期凋亡、改变细胞周期分布以及下调VEGFA和VEGFR2表达而展现初步抗肿瘤效应，但该效应可能部分是细胞毒性的继发结果。分子对接虽显示化合物107与VEGFA和VEGFR2具有潜在的较好结合，但其与VEGFR2的结合位点位于催化结构域C末端（非经典ATP结合口袋），提示其可能不作为经典的ATP竞争性激酶抑制剂。ADMET预测结果则强调化合物107当前结构不适合直接作为临床候选药物，但可作为先导化合物进行结构优化。研究结论指出，CRC组织中VEGFA和VEGFR2/KDR在基因和蛋白水平均较配对癌旁非肿瘤组织显著升高；化合物107在HT-29细胞中降低了代谢活力、增加了早期凋亡、改变了细胞周期分布并降低了VEGFA和VEGFR2/KDR表达，提供了该化合物体外抗肿瘤作用的初步证据。然而，这些发现不能证明其直接靶向VEGFA或VEGFR2，亦不构成VEGFR2直接抑制、通路阻断或抗血管生成活性的证据。未来需要通过激酶活性及磷酸化分析、功能性血管生成实验和体内模型来确认其作用机制，并通过结构优化和实验毒理研究克服ADMET预测的局限性。
