配位交联羧甲基壳聚糖-Mn2+水凝胶：体外cGAS-STING免疫刺激的构效关系研究

《Molecules》：Coordination-Crosslinked Carboxymethyl Chitosan-Mn2+ Hydrogel: Structure–Activity Relationship for In Vitro cGAS-STING Immune Stimulation

　　

摘要专业翻译 羧甲基壳聚糖（carboxymethyl chitosan, CMCS）与Mn2+均可刺激cGAS-STING通路，促进I型干扰素（type I interferons, I IFNs）等免疫因子的产生，从而调控机体免疫应答。本研究设计了一种缓释Mn2+的CMCS-Mn水凝胶，考察了CMCS与Mn2+对固有免疫的协同效应以及影响免疫应答的因素。最优凝胶配方为CMCS浓度1 mg/mL、MnCl2浓度0.02 mol/L，所得凝胶粒径为472.16 nm，多分散指数（polydispersity index, PDI）为0.35，Mn2+含量为1.488 mg/g，比表面积为4.74 m2/g。该水凝胶主要通过Mn2+与CMCS分子链上的氨基和羧基之间的配位相互作用形成，并表现出pH依赖的Mn2+释放行为。细胞实验表明，600 μg/mL CMCS-Mn2+水凝胶与5 μg/mL游离Mn2+的组合可产生最强的IFN-β诱导效果。该水凝胶兼具CMCS与Mn2+的协同免疫调节作用；其中氨基对CMCS的免疫活性至关重要，而Mn2+则发挥更为突出的作用。以Ca2+部分替代Mn2+可疏松交联网络，进一步调节Mn2+从水凝胶中的解离。

论文解读

一、研究背景与意义

cGAS-STING通路是宿主固有免疫的重要组成部分，在免疫治疗中发挥着关键作用。该通路可被细菌、病毒或肿瘤组织来源的双链DNA（dsDNA）激活，进而产生I型干扰素（type I interferons, IFNs）。I型干扰素连接固有免疫与适应性免疫，不仅具有广谱抗病毒作用，还能促进树突状细胞（DCs）的成熟与迁移，增强细胞毒性T淋巴细胞或自然杀伤细胞介导的细胞毒性，并保护效应细胞免于凋亡。因此，自STING被发现以来，研究者一直致力于寻找合适的cGAS-STING激动剂，以开发疫苗佐剂和抗癌药物。

锰是哺乳动物组织中含量最丰富的金属之一，在多种生理过程中发挥重要作用。作为新近鉴定的cGAS-STING激动剂，Mn²⁺可帮助宿主抵抗多种DNA病毒感染并抑制肿瘤细胞生长。然而，锰同时也具有毒性，过量锰暴露可损伤中枢神经系统、触发病理性免疫激活并造成不可逆的细胞和组织损伤。此外，锰对pH敏感且存在多种价态。为增强Mn²⁺在体内的固有免疫刺激活性、降低其副作用并防止氧化，需要一种新型载体来稳定Mn²⁺并控制其在体内的释放。

CMCS是壳聚糖的衍生物，具有良好的生物相容性和生物可降解性、止血抗菌性能、促进细胞增殖的能力以及免疫调节活性。其降解产物如氨基葡萄糖可被机体吸收或代谢而无毒副作用。CMCS分子链含有丰富的氨基和羧基，为金属离子提供了大量结合位点，被广泛用于水凝胶制备。CMCS同样可以刺激cGAS-STING通路并增强机体免疫应答。

基于上述背景，本研究设计并制备了CMCS-Mn水凝胶，旨在利用CMCS作为载体稳定Mn²⁺并控制其释放，同时利用两种组分各自的免疫活性实现协同增效，系统考察凝胶形成机制、IFN-β诱导能力以及影响免疫应答的因素。

二、主要技术方法

研究人员采用以下关键技术手段开展研究：以MnCl₂溶液滴入CMCS溶液经超声辅助制备CMCS-Mn水凝胶；利用傅里叶变换红外光谱（FT-IR）表征配位作用位点；采用X射线光电子能谱（XPS）分析Mn的价态及配位环境；通过动态光散射（DLS）测定凝胶粒径与多分散指数；使用扫描电子显微镜（SEM）观察微观形貌；采用氮气吸附-脱附法测定比表面积与孔径分布；利用原子吸收分光光度计测定凝胶中Mn²⁺含量及释放曲线；通过流变学测试验证凝胶弹性性质；以CCK-8法评估细胞毒性；采用Western blot检测IFN-β蛋白表达水平。细胞实验选用HeLa细胞系（来源于华中农业大学微生物与免疫学实验室），该细胞系保留完整的cGAS-STING通路且蛋白产量高，便于通过Western blot磷酸化分析研究激活机制。

三、研究结果

3.1 CMCS-Mn水凝胶的制备与表征

将MnCl₂溶液滴入CMCS溶液后迅速形成半透明水凝胶，质地柔软，具有典型的半固体水凝胶特性。倒置实验验证了水凝胶的自支撑性能。频率扫描流变学显示，在整个测试频率范围内储能模量（G′）始终高于损耗模量（G″），证实了弹性水凝胶的本质。不同CMCS和MnCl₂浓度制备的水凝胶冻干后Mn²⁺质量分数均约为1%，表明Mn²⁺主导交联过程，Mn²⁺含量对前驱体浓度不敏感。为降低原料消耗，选择1.0 mg/mL CMCS和0.02 mol/L MnCl₂为最优配方，锰负载量为1.488 mg/g。水合凝胶颗粒平均水动力直径为472.00 ± 4.00 nm，平均PDI为0.35 ± 0.04。冻干后纳米颗粒聚集体堆叠形成层状宏观骨架，凝胶骨架内平均孔径为99.9 ± 8.1 nm。氮气吸附-脱附测试显示IV型等温线和H3滞后环，表明存在由纳米颗粒堆叠产生的狭缝状介孔，比表面积为4.74 m²/g，总孔体积为0.0197 cm³/g，孔径分布以介孔（2–50 nm）为主，支持Mn²⁺的受控释放。

3.2 CMCS-Mn水凝胶的构建机制

采用不同阴离子的锰盐制备水凝胶，FT-IR显示CMCS羧酸根的不对称伸缩峰从1585 cm^?1移至约1575–1576 cm^?1，且所有凝胶在EDTA-2Na溶液中均于6 h内完全降解，表明凝胶化主要由CMCS-Mn²⁺相互作用控制而非盐阴离子。以CMC-Mn²⁺为对照，CMCS液滴形成凝胶球而CMC液滴无明显凝胶化，提示氨基参与配位。XPS分析证实Mn成功掺入CMCS基质，高分辨Mn 2p谱显示固体CMCS-Mn中Mn²⁺（59.6%）和Mn³⁺（40.4%）混合价态共存。与CMCS相比，CMCS-Mn的O 1s主峰向高结合能方向移动0.62 eV，羧基氧比例从58.8%增至65.8%；N 1s峰向高结合能方向移动0.36 eV，氨基氮比例降低。配位过程中O和N原子向Mn中心提供孤对电子，减少电子屏蔽从而增加结合能。固体XPS检测到的Mn³⁺仅反映材料表面电子状态，在生理水相条件下不稳定，且尚无研究证实其能激活cGAS-STING通路，因此CMCS-Mn诱导的免疫应答主要来源于水凝胶释放的Mn²⁺。上述结果表明，凝胶中Mn²⁺主要与CMCS分子链上的羧基和氨基配位，充当交联剂。

3.3 浓度筛选

CCK-8实验显示，CMCS在300–2100 μg/mL范围内维持细胞活力>90%，具有良好的生物相容性；Mn²⁺则呈现剂量依赖性细胞毒性，5–30 μg/mL无毒，随浓度升高细胞活力下降。Mn²⁺在5 μg/mL浓度时对IFN-β表达的诱导作用最强，约为对照组的1.6倍，随浓度升高效应减弱。CMCS-Mn水凝胶在600 μg/mL浓度时诱导最高IFN-β表达（约为对照组的2.1倍），浓度升高或降低效应均减弱，呈先升后降趋势。Mn²⁺和CMCS-Mn水凝胶的最佳刺激浓度分别为5 μg/mL和600 μg/mL。

3.4 CMCS与Mn²⁺的协同免疫刺激效应

在CMCS 300 μg/mL + Mn²⁺ 10 μg/mL、CMCS 300 μg/mL + Mn²⁺ 30 μg/mL、CMCS 900 μg/mL + Mn²⁺ 10 μg/mL和CMCS 900 μg/mL + Mn²⁺ 30 μg/mL四种组合中，细胞活力均保持较高水平。各组合的IFN-β表达水平分别为对照组的约1.6倍、1.5倍、1.9倍和1.8倍，均高于相应单一组分处理组，表明CMCS与Mn²⁺之间存在协同免疫效应。基于水凝胶消化得到的CMCS与Mn²⁺质量比约100:1，研究人员选择500 μg/mL CMCS和5 μg/mL Mn²⁺进行后续研究。5 μg/mL Mn²⁺组IFN-β表达约为对照组的1.4倍，500 μg/mL CMCS组约为1.5倍，500 μg/mL CMCS + 5 μg/mL Mn²⁺混合物组约为1.7倍，而凝胶组约为2.1倍。采用Bliss独立模型计算，物理混合物的CI_Bliss值约为2.13，CMCS-Mn水凝胶约为2.63，表明水凝胶交联后具有更强的协同IFN-β激活效应。

3.5 CMCS-Mn水凝胶免疫刺激持续时间与Mn²⁺释放的关系

在弱酸性条件下，CMCS上氨基和羧酸根质子化竞争性破坏与Mn²⁺的配位键，加速早期离子释放。在所有测试pH值下，Mn²⁺在前6 h内快速释放，之后释放速率降低并逐渐趋于平台，表现出pH响应释放行为。pH 7.4时平衡累积释放量为1363.3 μg。Korsmeyer–Peppas模型拟合显示，pH 5.5、6.8和7.4下的扩散指数n分别为0.12172、0.15624和0.15803，均小于0.43，确认Mn²⁺释放以Fickian扩散为主。速率常数k随pH升高而逐渐减小，表明酸性条件下Mn²⁺扩散更快。刺激持续时间对IFN-β表达的影响与凝胶中Mn²⁺释放速率基本一致：4 h时IFN-β表达无显著差异，6 h至12 h刺激效应随Mn²⁺释放逐渐增强。Mn²⁺释放动力学与IFN-β表达的相关性表明，在凝胶诱导cGAS-STING通路刺激过程中，Mn²⁺作为关键激动剂发挥比载体材料CMCS更强的作用。

3.6 影响CMCS-Mn免疫效应的因素

采用MnCl₂、MnSO₄、MnAc₂和Mn(NO₃)₂四种锰盐制备凝胶，各凝胶组的IFN-β表达水平分别为对照组的约1.5倍、1.5倍、1.4倍和1.5倍，无统计学显著差异，表明凝胶中阴离子类型对IFN-β诱导影响极小，凝胶的免疫学性能主要由Mn²⁺和CMCS决定。

对四种骨架结构相似的多糖（CMCS、CMC、CS和N-CMCS）进行比较，CMCS组IFN-β表达约为对照组的1.4倍，CMC组约为1.0倍，CS组约为1.6倍，N-CMCS组约为0.8倍。含氨基的CS和CMCS显著促进IFN-β表达，而缺乏游离氨基的CMC和N-CMCS无明显的刺激效应，表明游离氨基是CMCS免疫活性的关键官能团。N-CMCS-MnCl₂凝胶组IFN-β表达仅为对照组的0.8倍，而CMCS-MnCl₂凝胶组增至约1.5倍，CMC-MnCl₂凝胶组无明显增强。

制备不同表面电位的水凝胶，CMCS-MnCl₂凝胶组IFN-β表达为对照组的1.4倍，CMCS-MnCl₂-CS凝胶组为1.5倍，CMCS-CaCl₂-CS凝胶组为1.2倍，CMCS-MnCl₂-SA凝胶组为0.9倍。添加CS壳层增加水凝胶诱导的IFN-β表达，而添加SA壳层则降低表达，表明IFN-β诱导取决于外层壳层。但壳层表面电位对IFN-β诱导无显著影响，结合壳聚糖刺激cGAS-STING通路的机制，水凝胶可能在进入细胞后发挥作用。

利用CaCl₂和MnCl₂混合溶液制备一系列不同Mn²⁺浓度的混合离子水凝胶。CMCS-MnCl₂凝胶组IFN-β诱导为对照组的1.3倍，CMCS-CaCl₂凝胶组为1.1倍，CMCS组为1.2倍。CMCS-CaCl₂凝胶组效应与CMCS组相近，表明Ca²⁺在该体系中不能直接诱导cGAS-STING免疫激活。随着Mn²⁺浓度降低，IFN-β诱导相应下降，分别为对照组的2.2倍、1.7倍、1.3倍和1.1倍。在较高Mn²⁺含量下，Ca²⁺在一定程度上增强Mn²⁺诱导的IFN-β表达。Ca²⁺对CMCS的结合亲和力低于Mn²⁺，导致微颗粒结构堆积更松散，因此Ca²⁺部分替代Mn²⁺可能疏松混合离子水凝胶的交联网络，从而促进Mn²⁺从凝胶中释放。此外，Mn²⁺与Ca²⁺具有相似的离子半径和电荷，Mn²⁺可渗透电压门控钙通道，低浓度Ca²⁺可能通过该途径促进细胞对Mn²⁺的摄取。低比例Ca²⁺下观察到的增强免疫应答表明，可在降低Mn²⁺用量的同时实现相当的免疫刺激效果，为减少Mn²⁺剂量和限制Mn²⁺生物蓄积风险提供了思路。

四、讨论与结论

本研究存在以下局限性：HeLa细胞系为肿瘤来源细胞而非专职固有免疫细胞，结果仅能确认材料可激活cGAS-STING通路，不能独立确立免疫激活；IFN-β作为免疫读数可由多种固有免疫和细胞应激通路诱导，IFN-β升高本身不能确认cGAS-STING信号的特异性激活。未来研究将检测cGAS-STING通路上游蛋白的磷酸化，并在巨噬细胞系（RAW264.7和THP-1）中评估免疫应答。

研究结论：本研究以CMCS为载体，通过CMCS与Mn²⁺之间的相互作用制备CMCS-Mn水凝胶，在控制Mn²⁺释放的同时利用两种组分的免疫活性。水凝胶主要通过CMCS的氨基和羧基与Mn²⁺之间的配位键形成。结果表明，CMCS和Mn²⁺具有协同免疫效应，CMCS-Mn水凝胶增强了这种协同作用。水凝胶免疫活性的持续时间与凝胶内Mn²⁺的缓释曲线相关。不同锰盐制备的水凝胶中阴离子类型对IFN-β表达影响甚微，表明Mn²⁺在凝胶免疫功能中发挥主要作用。对多种结构相似多糖的比较证明，氨基是CMCS免疫活性的关键官能团。