《Molecules》：Carbon Dots Derived from Carbonized Citri Reticulatae Pericarpium (Chenpi) Alleviate Metabolic Dysfunction-Associated Steatohepatitis
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代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）的全球患病率持续上升，而已获批的靶向治疗药物伴随明显的不良反应。本研究合成了源自橘皮（Citri Reticulatae Pericarpium，CRP）的碳点（CRP-CDs），以考察其安全性及对MASH的治疗作用。研究
代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）的全球患病率持续上升，而已获批的靶向治疗药物伴随明显的不良反应。本研究合成了源自橘皮（Citri Reticulatae Pericarpium，CRP）的碳点（CRP-CDs），以考察其安全性及对MASH的治疗作用。研究人员通过高温碳化法合成了新型CRP-CDs，并对其粒径、表面官能团及光学性质进行了系统表征；评估了CRP-CDs的体外与体内生物安全性；采用游离脂肪酸（FFA）诱导的脂肪变性HepG2细胞模型考察其对肝脏脂质蓄积的调控作用，同时采用高脂饮食（HFD）诱导的小鼠模型评价其抗MASH的治疗效果；并通过数据非依赖采集质谱（DIA-MS）定量蛋白质组学解析其抗MASH的分子机制。结果表明，表征试验显示CRP-CDs粒径均一、表面官能团丰富且光学行为稳定。体外研究证实CRP-CDs具有优异的生物相容性，CRP-CDs处理可有效降低细胞内甘油三酯（TG）和总胆固醇（TC）水平。给予CRP-CDs可改善HFD诱导MASH小鼠升高的血清生化指标。组织学检查进一步揭示了CRP-CDs对HFD喂养所致肝损伤的保护作用。此外，CRP-CDs降低了肝脏白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及丙二醛（MDA）水平，并提高了超氧化物歧化酶（SOD）活性及谷胱甘肽（GSH）含量。蛋白质组学结果分析表明，CRP-CDs通过协同调控多条信号级联通路而非作用于单一通路来缓解MASH的发病进程。此外，体内毒性评估验证了CRP-CDs良好的全身生物安全性，小鼠未见明显不良毒性效应。综上所述，新型CRP-CDs是一种环境友好且生物相容的纳米材料，能够有效缓解HFD触发的MASH，有望作为脂肪性肝病临床前治疗开发的候选物。值得注意的是，上述结果源自临床前短期动物研究，临床转化前仍需进一步验证。
代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（metabolic dysfunction-associated steatohepatitis，MASH）曾被称为非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH），目前被视为代谢功能障碍相关脂肪性肝病（metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease，MASLD）的炎症性与进展性亚型。2023年全球受累人群达13亿，占全球人口的16.1%，给社会带来沉重的现实与潜在健康及经济负担。MASH以肝脂肪变性伴小叶内炎症和肝细胞气球样变为特征，可伴或不伴纤维化；随着疾病进展，MASH可发展为肝硬化和肝衰竭，显著升高肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的发生风险。随着全球肥胖患病率上升，MASH已成为增长最快的肝癌危险因素。瑞美替罗（Resmetirom）是首个获美国食品药品监督管理局（FDA）批准的口服抗MASH药物，在966例患者的III期试验中显著改善肝脏病变与脂质代谢，但其频发的胃肠道不良反应严重损害患者治疗耐受性。因此，探索兼具强效与更佳安全性的新型抗MASH治疗药物至关重要。
碳点（carbon dots，CDs）是一类直径小于10 nm的零维碳纳米材料，具有粒径小、生物相容性优异、水溶性高及表面易功能化等独特优势。中药（traditional Chinese medicine，TCM）资源丰富、药效温和，具有多成分、多靶点治疗特点，已广泛用于多种慢性疾病的预防与临床干预。基于中药资源与纳米技术的结合，以天然中药或其活性成分为碳前体，可通过生态友好、简便的绿色合成途径成功制备中药来源碳点（TCM-derived carbon dots，TCM-CDs）。该绿色合成策略使TCM-CDs能够完美继承并保留中药前体的核心药理活性，同时整合碳点的独特纳米尺度优势。既往研究已证实TCM-CDs对多种病理过程尤其是代谢紊乱与炎症反应具有优异的调控与治疗作用。因此，TCM-CDs已成为治疗和干预代谢性与炎症性疾病的有前景的新型纳米治疗剂，为开发高效低毒的生物医学治疗材料提供了新思路。
橘皮（Citri Reticulatae Pericarpium，CRP，即陈皮）作为经典药食同源中药，传统上用于改善肝脏疾患，富含黄酮类、多酚类等生物活性含碳成分。然而，这些柑橘类黄酮水溶性差、口服生物利用度低，极大限制了其临床转化，凸显了对替代制剂策略的需求。在此背景下，CRP可作为制备功能性碳点的理想低成本、绿色且生物相容的前体。本研究成功将CRP转化为CRP来源碳点（CRP-CDs），评估了CRP-CDs的体外生物安全性，并利用FFA诱导的脂肪变性细胞模型考察其对肝脏脂质蓄积的调控作用；进一步探究了CRP-CDs对HFD诱导MASH的保护作用；采用DIA-MS定量蛋白质组学进一步阐明介导该保护作用的核心调控信号通路，同时对CRP-CDs的体内全身生物安全性进行了综合评价。本研究旨在为MASH治疗提供一种新型低毒天然纳米治疗候选物。
在关键技术方法方面，研究人员以橘皮（CRP）为碳源，采用高温碳化（350 °C煅烧1 h）结合水提、0.22 μm滤膜过滤及1000 Da透析袋透析7天纯化的方法制备CRP-CDs，并借助透射电子显微镜（TEM）、X射线衍射（XRD）、紫外-可见光谱（UV-Vis）、荧光光谱（FL）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）及X射线光电子能谱（XPS）完成系统表征。细胞实验采用HepG2与HK-2细胞，通过CCK-8法评价细胞毒性，以油红O（ORO）染色与CCK-8筛选FFA造模浓度并检测细胞内TG、TC水平。动物实验采用雄性C57BL/6小鼠，HFD喂养16周建立MASH模型，自第12周起连续4周灌胃给予CRP-CDs（5.00与1.25 mg/kg），检测血清生化指标、肝脏组织病理（H & E与油红O染色）及炎症与氧化应激标志物。机制研究采用DIA-MS定量蛋白质组学（Orbitrap Exploris 480质谱仪，DIA-NN v2.0分析，GSEA富集分析）。急性毒性评价采用SPF级昆明（KM）小鼠腹腔注射20.85 mg/kg CRP-CDs，7天后进行血常规、血清生化及主要脏器H & E染色检查。
研究结果方面，2.1 合成与表征：以陈皮为碳源经高温煅烧成功合成CRP-CDs，TEM显示其分散良好、呈球形，粒径0.70~1.90 nm，平均1.30 ± 0.23 nm，均小于10 nm；高分辨TEM显示0.22 nm晶格间距对应石墨（100）晶面；XRD在21~23°出现宽衍射信号，证实其无定形结构；荧光表征显示最佳激发波长λ
ex = 339 nm时于λ
em = 453 nm处发射强而对称的特征荧光峰，Stokes位移达114 nm；FTIR与XPS证实表面含-C=O、-OH、-CN、C–O等官能团，主要元素为C（67.05%）、O（28.43%）、N（4.00%）、P（0.52%），zeta电位为+1.8 mV，接近中性。2.2 体外生物活性评价：CCK-8显示CRP-CDs浓度高达500 μg/mL作用24与48 h后细胞存活率仍高于85%，体外生物相容性突出；0.5 mM FFA可显著诱导HepG2细胞内脂质蓄积且无明显细胞毒性，被确定为造模浓度；CRP-CDs（125、62.5、31.25 μg/mL）处理可显著降低细胞内TG与TC含量（p < 0.01），表明其可有效改善FFA诱导的脂质代谢异常。2.3 CRP-CDs减轻HFD诱导的小鼠MASH：HFD喂养16周成功建立MASH模型，CRP-CDs干预显著降低升高的小鼠体重（p < 0.01）；与模型组相比，CRP-CDs治疗组血清AST、ALT、TG、TC、LDL水平明显降低（* p < 0.05），HDL水平明显升高（* p < 0.05）；H & E染色显示CRP-CDs有效减轻肝组织学病变，抑制肝细胞空泡化与气球样变，减少炎性细胞浸润；油红O染色显示CRP-CDs显著减少脂滴数量与面积，改善肝脂肪变性。2.4 CRP-CDs抑制肝脏炎症与氧化应激：HFD诱导MASH模型组肝组织TNF-α、IL-1β、IL-6及脂质过氧化产物MDA水平显著升高，SOD活性与GSH水平显著降低，而CAT活性组间无显著差异；CRP-CDs干预后TNF-α、IL-6、IL-1β及MDA水平显著降低，SOD活性与GSH含量显著升高（p < 0.05），CAT活性各组间仍无统计学差异。2.5 肝组织蛋白质组学分析：采用DIA-MS对对照组、模型组与CRP-CDs治疗组肝组织进行蛋白质组学分析，主成分分析（PCA）显示三组明显分离；模型组相对对照组筛选出1051个差异表达蛋白（DEPs），CRP-CDs治疗组相对模型组鉴定出91个DEPs，两组比较共共享67个共同DEPs；GSEA显示MASH肝组织中线粒体能量代谢通路（氧化磷酸化、电子传递链、ATP合成、线粒体转录与翻译）整体受抑，伴核苷酸/氨基酸代谢紊乱及细菌应答免疫通路过度激活，CRP-CDs干预可使上述失调通路正常化； hallmark基因集GSEA气泡图提示氧化磷酸化为最显著富集的通路之一，表明CRP-CDs可能有助于恢复线粒体能量稳态。2.6 CRP-CDs体内生物安全性评价：以20.85 mg/kg高浓度静脉注射小鼠一周，血清肝功能指标（ALT、AST）、肾功能指标（BUN、CRE）及其他关键生化指标（TG、TC、ALP）较对照组均无显著异常；血常规显示白细胞、红细胞、血小板、血红蛋白等血液学指标正常；主要脏器（心、肝、肺、肾、脾）脏器系数无统计学差异，H & E染色显示组织结构完整，无明显炎症浸润、细胞坏死或病理病变，全面证实CRP-CDs具有优异的生物相容性。
讨论部分指出，随着MASH全球患病率上升，其已成为代谢健康的重要威胁，而现有药物干预常受制于明显副作用且难以提供安全、长期的疾病管理。TCM-CDs以天然药材为碳前体经绿色合成制备，毒性低、生物相容性优异，并保留原药材固有生物活性，是极具前景的新型治疗剂。本研究成功以CRP为天然碳前体经碳化制备绿色合成的CRP-CDs，其粒径分布较均一、呈准球形且小于10 nm、分散良好；结构表征证实其表面富含多种含氧官能团，有助于增强抗氧化能力与生物相容性；光学光谱证实其典型碳点荧光特性。生物相容性是纳米材料生物医学转化的首要前提，基于HepG2与HK-2细胞的体外细胞毒性试验证实CRP-CDs在有效治疗浓度范围内细胞毒性可忽略；体内生物相容性评价进一步表明CRP-CDs未对小鼠主要脏器与生理功能造成明显损伤，急性给药后血常规与生化标志物无明显异常，提示在所测条件下未诱发严重的亚临床造血、肝或肾损伤。鉴于其良好低毒性特征，CRP-CDs在慢性病干预方面具有前景，但仍需长期重复给药毒性研究以充分确认其生物安全性。本研究MASH治疗模型与急性毒性评价在给药途径上存在方法学差异，研究人员将其视为本研究的局限性：腹腔注射（i.p.）急性毒性试验仅作为初步筛查系统吸收后全身毒性潜力的试验，不能替代与长期治疗方案相匹配的重复给药经口毒性评价；既往文献表明i.p.给药可经腹膜毛细血管与淋巴管快速吸收，广泛用于啮齿类动物初步全身毒性筛查，纳米材料体内成像研究也证实i.p.注射的纳米颗粒可在0.5~3 h内进入血流及主要脏器（肝、肾、脾），因此当前i.p.毒性数据不能完全反映口服CRP-CDs的体内安全性。作为临床常用中药，CRP具有改善和调控病理性肝损伤的能力；肝脏脂质过度蓄积是MASH的始动与核心病理特征，以TC和TG异常升高为特点，脂质过载进一步触发炎性细胞浸润与肝组织损伤。本研究采用FFA诱导的HepG2脂肪变性细胞模型模拟肝脂肪变性的体外病理状态，结果显示CRP-CDs可有效降低TC与TG，表明其能逆转脂质代谢紊乱、减轻肝脂肪变性；但该体外细胞实验存在固有局限，HepG2为肿瘤来源的人肝母细胞瘤细胞系，基础脂质代谢异常且细胞色素P450表达受抑，可能改变细胞对脂质应激与CRP-CDs干预的应答，然而凭借其人源遗传背景与稳定的脂质蓄积能力，HepG2仍是MASH初步机制研究广泛使用的细胞模型。HFD诱导MASH小鼠模型是经典临床前模型，可重现人类MASH核心病理特征；长期持续HFD喂养导致肝细胞内大量脂滴蓄积，伴明显小叶内炎症浸润与肝细胞气球样变；组织病理学观察显示HFD诱导MASH小鼠肝组织明显肝脂肪变性、肝脂质过度沉积与炎性细胞浸润，血清生化检测显示肝损伤相关标志物升高，反映该MASH模型肝损伤的建立；CRP-CDs干预后上述病理改变明显减轻，血清肝损伤生化指标降低，支持CRP-CDs对MASH的保肝作用。此外，模型组肝脏典型促炎细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平及脂质过氧化关键终产物MDA含量明显升高，主要抗氧化酶SOD活性与GSH水平明显受抑，这些炎症与氧化应激生物标志物的剧烈改变强烈提示HFD有效诱导了强烈肝脏炎症激活与内源性抗氧化防御系统受损，模拟了MASH的炎症与氧化病理表型。本研究证实CRP-CDs对HFD触发的肝脂肪变性与炎症病变具有强效保护作用，这些纳米颗粒明显降低血清生化指标，减少肝脏促炎细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）及脂质过氧化产物MDA，同时上调SOD活性与GSH含量以重建肝脏抗氧化防御系统；这些发现验证了CRP-CDs通过改善脂质沉积、抑制炎症、缓解氧化应激等多维效应改善MASH相关病变，这可能归因于纳米颗粒表面丰富的官能团。为进一步解析CRP-CDs保护MASH的分子机制，采用DIA-MS定量蛋白质组学系统筛选CRP-CDs干预后MASH肝组织中的差异表达蛋白，整合蛋白质组学分析鉴定出67个在MASH小鼠中改变并被干预逆转的重叠差异表达蛋白，这些重叠蛋白呈现相互表达变化：在HFD诱导MASH模型中上调的蛋白在治疗后大多下调，而在MASH状态下受抑的蛋白则恢复至对照动物水平；鉴于差异表达蛋白数量相对较少，研究人员对全部定量蛋白质组进行GSEA，基因集富集分析发现线粒体能量代谢通路显著富集。研究结果表明，CRP-CDs干预在细胞与动物模型中明显缓解脂质沉积、炎症浸润与氧化损伤；在病理性MASH条件下，肝细胞内大量脂质堆积严重破坏线粒体呼吸，氧化磷酸化受损使跨膜质子动力势崩溃、ATP生物合成受阻，导致广泛的线粒体生物能学衰竭，这种能量缺乏进而放大肝脏氧化应激与强烈的促炎级联反应，形成加速MASH恶化的恶性循环。然而，这些蛋白质组学观察仅证明相关性关联，不能确立因果关系；蛋白丰度改变可能反映继发性适应反应而非肝脏保护的原发驱动因素。本研究存在局限性：蛋白质组学与GSEA结果仅支持CRP-CDs介导的保护与受扰线粒体能量代谢之间的相关性关联，未对关键蛋白或线粒体功能进行正交验证，因此无法确立因果关系，也不确定这些蛋白质组学变化是直接分子应答还是继发性适应事件；尚需进一步工作验证候选蛋白并深入探究线粒体功能改变，以全面阐明CRP-CDs抗MASH的精确机制。
研究结论部分译文：本研究采用绿色碳化方法制备了CRP-CDs，其具有良好的生物相容性并可缓解HFD诱导的MASH。蛋白质组学分析揭示CRP-CDs并非作用于单一靶点，线粒体能量代谢构成CRP-CDs介导保护作用的核心调控轴。该制剂可能协同平衡脂肪生成、抗氧化与炎症信号，逆转MASH中多方面的病理功能障碍。上述发现有望为MASH提供一种新型、安全且有效的治疗策略。但本研究仍局限于细胞与临床前动物模型，尚需针对长期生物安全性与线粒体相关机制的深入验证开展进一步研究，以推进中药来源碳点的转化潜力。
