《Molecules》：Integrated Pan-Cancer Analysis and Functional Characterization of ATPSCKMT in Hepatocellular Carcinoma
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肝细胞癌（HCC）仍是癌症死亡的主要原因，凸显了鉴定具有功能相关性的分子决定因素的必要性。研究人员利用泛癌基因组、转录组、生存及依赖性数据集，系统评价了38个被归类为甲基转移酶样（METTL）家族成员和/或七β链赖氨酸甲基转移酶（7BS KMT）的基因，随后在
肝细胞癌（HCC）仍是癌症死亡的主要原因，凸显了鉴定具有功能相关性的分子决定因素的必要性。研究人员利用泛癌基因组、转录组、生存及依赖性数据集，系统评价了38个被归类为甲基转移酶样（METTL）家族成员和/或七β链赖氨酸甲基转移酶（7BS KMT）的基因，随后在HCC细胞系中进行了功能评估。整合分析将ATP合酶c亚基赖氨酸甲基转移酶（ATPSCKMT）优先用于肝细胞癌（LIHC）的研究，其表达升高与不良预后相关。DEMETER2分析还发现其在多种癌症类型中具有广泛的RNAi依赖性。在JHH7和HEP3B细胞中，siRNA介导的ATPSCKMT敲低降低了CCK-8信号和EdU掺入。网络与共表达分析确定CCT5为代表性的ATPSCKMT相关候选基因，并在独立HCC队列中呈现可重复的正相关。在TCGA-LIHC中，ATPSCKMT–CCT5相关性在校正共享局部拷贝数变异后仍然存在（偏Spearman ρ = 0.522）。对原发HCC恶性肝细胞的单细胞分析进一步揭示了患者水平的共检出，尽管这些发现可能受转录本检出差异的影响。总体而言，研究人员的发现支持进一步研究ATPSCKMT在HCC增殖相关表型中的作用，并确定CCT5为可重复的共表达候选基因。
**研究背景与科学问题**
肝细胞癌（HCC）是全球癌症死亡的主要原因之一，其病因多样、分子异质性显著，治疗后复发与耐药仍是长期生存的主要障碍。尽管大规模基因组和转录组研究已揭示HCC的分子多样性与反复出现的基因组改变，但仍需鉴定并功能验证参与癌细胞增殖与存活的分子决定因素。甲基转移酶通常以S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）为甲基供体，将甲基转移至RNA、蛋白质等底物。蛋白质赖氨酸甲基化是一种翻译后修饰，不仅发生于组蛋白，也发生于转录因子、分子伴侣、翻译因子和线粒体蛋白等非组蛋白。根据催化结构域结构，蛋白质赖氨酸甲基转移酶（KMT）主要分为SET结构域型和七β链（7BS）型。许多带有甲基转移酶样（METTL）命名的甲基转移酶采用7BS结构，而部分结构相关的7BS赖氨酸甲基转移酶因靶底物不同而有不同基因名称。因此，仅分析带有METTL命名的基因可能遗漏结构与功能相关的甲基转移酶。研究人员因此构建了包含METTL家族和/或7BS KMT基因的扩展分析集（共38个基因，分为METTL家族仅含24个、METTL家族+7BS KMT 9个、7BS KMT仅含5个）。ATPSCKMT（原名FAM173B）是一种线粒体7BS赖氨酸甲基转移酶，可对线粒体ATP合酶c亚基Lys-43进行三甲基化；其缺陷所致的Lys-43甲基化缺失与c亚基异常掺入ATP合酶复合物、ATP生成能力下降及线粒体呼吸受损相关。然而，ATPSCKMT在各癌症中的基因组改变、表达模式及其与癌细胞依赖性和患者结局的关系尚未被系统评价，其在HCC中的表达、增殖相关功能及分子特征亦不明确。本研究旨在对扩展的METTL/7BS KMT分析集进行系统的泛癌表征，并评估ATPSCKMT在HCC中的功能相关性及关联分子特征。
**关键技术方法**
研究人员利用cBioPortal的TCGA PanCancer Atlas数据进行基因组改变分析；利用GDC的STAR-Counts RNA测序数据（TPM）行肿瘤与正常组织差异表达分析（Wilcoxon秩和检验，Benjamini–Hochberg校正）；结合TCGA-CDR临床数据行Cox比例风险回归与Kaplan–Meier生存分析；利用DepMap的DEMETER2 RNAi数据集及Chronos处理的CRISPR–Cas9基因效应评分进行依赖性分析；独立HCC队列来自HCCDB数据库（排除与TCGA-LIHC重叠的HCCDB15）；单细胞数据来自GEO数据集GSE149614（10例原发HCC）；细胞实验使用JHH7与HEP3B细胞系行siRNA敲低，并以CCK-8与EdU掺入实验评估增殖。
**研究结果**
2.1 METTL与7BS KMT基因的反复基因组改变与表达及患者生存相关：基于TCGA PanCancer Atlas数据，突变、结构变异、扩增、深缺失等广泛分布于各癌种，扩增与突变为主要改变类型。ATPSCKMT为扩增频率最高的基因，以拷贝数扩增为主；METTL3为突变频率最高者。METTL1与ATPSCKMT的mRNA表达随拷贝数递增，扩增组最高；伴METTL1扩增患者（n = 242）总生存显著短于无扩增者（n = 10,377；log-rank p < 1 × 10
?10），伴ATPSCKMT扩增患者（n = 326）总生存亦显著较短（n = 10,293；log-rank p = 0.0014）。METTL3与METTL4突变分布于全蛋白序列，分别见MT-A70结构域内R508G/C/H及W449*/C/R反复改变，突变组与未突变组总生存分布存在显著差异（p = 0.0321与p = 0.0383），且早期随访中突变组生存概率较高。
2.2 METTL/7BS KMT基因广泛失调且总体以上调为主：在21个TCGA癌种的肿瘤与正常组织比较中，多数基因在更多癌种中上调而非下调；EEF1AKMT4上调最广（12个癌种），METTL24下调最广（11个癌种）。CHOL上调基因最多（31个上调、2个下调）；LIHC中达预设标准的13个基因全部上调；KICH则呈相反模式（18个下调、1个上调）。
2.3 METTL/7BS KMT基因表达与患者预后反复相关：Cox回归显示多个基因表达与总生存（OS）及无进展间期（PFI）显著相关，高表达更多与不良结局相关；单基因最多在7个癌种（OS）和6个癌种（PFI）中显著；校正年龄与性别后显著性仍见于多个癌种，不良关联占优的总体格局保持不变。
2.4 依赖性分析鉴定ATPSCKMT为广谱敲低敏感基因：在DEMETER2数据集的20个可评估基因中，ATPSCKMT在多数癌种呈负得分且依赖性总体强于其他基因；以平均DEMETER2得分< ?0.3为标准，ATPSCKMT在23个可评估癌种中的22个（95.7%）达到阈值，其余基因均未达此标准。而在Chronos数据集中，ATPSCKMT未在任何45个可评估癌种组达到同一描述性阈值，另有12个基因至少在1个组达标，提示RNAi与CRISPR依赖性谱存在明显差异；癌种优先级基于DEMETER2分析，Chronos结果作为补充证据单独报告。
2.5 整合泛癌证据优先确定LIHC：将表达升高、不良预后关联与强RNAi依赖性分别转换为0–100的方向性百分位评分，反方向证据记零，不可用证据留空；LIHC在三个域均可评估且得分较高，等权整合后综合证据得分最高（81.5），明显高于第二位UCEC（56.1）、LUSC（52.7）与SKCM（51.7）。在仅纳入三域数据完整的13个癌种的完整病例分析中，LIHC仍居首（91.7）；13种替代评分情景下LIHC在保留三域的加权模型中均列第一，而单指标分析排序波动（表达第二至RNAi依赖性第十）；对表达、OS与PFI施加p < 0.05名义阈值后LIHC仍保持第一。
2.6 ATPSCKMT在HCC中反复上调并支持HCC细胞增殖：多HCC队列中ATPSCKMT显著上调且无反复下调模式；JHH7与HEP3B细胞中siRNA敲低使mRNA降至对照一半以下，CCK-8吸光度于第5天显著降低，EdU阳性细胞比例明显减少。
2.7 ATPSCKMT表达与增殖相关Hallmark程序反复相关：TCGA-LIHC中ATPSCKMT表达与E2F TARGETS、G2M CHECKPOINT、MITOTIC SPINDLE、MYC TARGETS V1及V2等增殖相关signature正相关；在14个独立HCCDB队列（排除HCCDB15）中上述正关联可重复观察到。
2.8 网络与多队列共表达分析鉴定可重复的ATPSCKMT关联基因：整合STRING功能关联、STRING物理互作与BioGRID数据后保留20个非冗余候选；TCGA-LIHC原发肿瘤中CCT5与ATPSCKMT正相关最强（Spearman ρ = 0.567，FDR校正p = 1.2 × 10
?31）；因两者均位于5p15.2，在362例具匹配表达与ASCAT3拷贝数数据的肿瘤中，校正共享局部拷贝数变异前后相关均保持阳性（校正前ρ = 0.563；偏Spearman ρ = 0.522，p < 0.001）。14个独立HCCDB队列随机效应meta分析中，CMBL合并相关最高（ρ = 0.331，95% CI = 0.244–0.413），其次为CCT5（ρ = 0.318，95% CI = 0.182–0.442）；METTL18、METTL21A、TRMT112与METTL22经FDR校正后亦呈显著正相关。
2.9 ATPSCKMT阳性恶性肝细胞中多个候选基因检出增加：GSE149614中鉴定13,691个恶性肝细胞，其中1765个（12.9%）可检出ATPSCKMT，患者间比例5.8%–24.6%；ATPSCKMT阳性细胞中TRMT112（97.1%）、CCT5（89.9%）与CMBL（82.5%）共检出频率高，六个候选基因在阳性细胞中检出频率均高于阴性细胞（如CCT5为89.9% vs 68.3%）；患者水平上CCT5、CMBL与TRMT112在全部10例患者中均于阳性细胞中检出更高（Wilcoxon FDR = 0.0118），METTL21A在8/10例同向（FDR = 0.0485），METTL18与METTL22未达显著。但阳性细胞中位nCount_RNA（29,033 vs 12,736）与nFeature_RNA（4614 vs 2858）更高（均p < 0.001），测序深度与转录本检出差异可能影响共检出模式，应视为描述性关联。
**讨论与结论**
讨论指出，既往研究多聚焦单个METTL酶，纳入结构相关非METTL 7BS赖氨酸甲基转移酶的系统比较仍有限；扩展基因集呈现异质性基因组改变、表达变化与预后关联，与各成员底物特异性和生物学功能的多样性一致，不应假定其共享同一分子机制。整合优先级框架旨在识别获多域汇聚证据支持的癌种，而非生成临床预测评分；尽管LIHC在完整病例分析与多种加权方案下排序稳定，该框架仍属探索性、未经独立验证，缺失证据记零不等于生物学上无关联。RNAi与CRISPR依赖性谱的差异原因尚未阐明，两类结果应视为不可互换的证据。细胞实验中CCK-8反映代谢活性与活细胞数、EdU反映DNA合成，均不支持对机制的确定推断，且线粒体呼吸、ATP生成、底物甲基化及HIF-1α等相关信号未直接评估。CCT5编码CCT/TRiC伴侣素复合物亚基，参与肌动蛋白与微管蛋白折叠及有丝分裂进程，且属于HALLMARK_MYC_TARGETS_V1基因集，既往报道其影响HCC细胞增殖、集落形成与细胞周期进程，但本研究未证明CCT5介导敲低后的增殖相关表型，也未确立ATPSCKMT–CCT5调控轴。单细胞结果受文库复杂度与 dropout 影响，仅支持候选基因优先排序而非机制验证。局限性包括：依赖回顾性公共数据集不能确立因果；完整病例分析仅限13个癌种可能存在选择效应；功能验证仅限两种细胞系的siRNA敲低，缺乏线粒体酶活性、ATP生成、底物甲基化及功能回复实验；单细胞结果来自单一患者队列。
结论部分译述：总之，METTL/7BS KMT基因的泛癌分析揭示了反复出现的基因组改变、表达失调及与患者结局的关联。整合表达、预后与RNAi依赖性数据将LIHC优先用于ATPSCKMT的进一步研究，且该排序在替代三域加权方案下保持稳定。ATPSCKMT敲低降低两种HCC细胞系的CCK-8信号与EdU掺入，其表达在HCC队列中与增殖相关Hallmark程序相关。这些发现支持ATPSCKMT在增殖相关表型中的潜在作用，但其线粒体机制未被直接检验。CCT5在独立HCC队列中成为可重复的ATPSCKMT共表达候选，相关性在校正共享局部拷贝数变异后持续存在；其已知的CCT/TRiC依赖性蛋白折叠参与提供了生物学背景，但现有数据未确立与ATPSCKMT的直接功能关系，尚需进一步机制研究予以阐明。
