基于拉曼光谱比率指标的乳制品加工历史判别研究

《Molecules》：Investigation of Ratiometric Indices for Determining the Technological History of Dairy Systems Using Raman Spectroscopy

　　

摘要 确定食品加工历史，特别是检测未申报的使用复原配料替代新鲜配料的行为，仍然是一项严峻的挑战。在乳制品体系中，此类检测较为困难，因为常规化学标志物反映的是时间和温度变化的累积历史，而非特定的加工步骤。尽管拉曼光谱被广泛认为是一种无损、高通量的分子改变筛查工具，但仍需具有物理化学可解释性的比率指标，尤其是用于可解释人工智能模型时。为识别诊断性光谱差异，研究人员对同一批原料全脂生牛乳在不同状态下进行了评估：生乳、巴氏杀菌乳（76、88和98 °C）以及出口空气温度≤70 °C和约95 °C条件下喷雾干燥的乳粉。所得全脂乳粉复水至12.1%总固形物质量分数。使用M532显微镜（λ = 532 nm）采集拉曼光谱，并确定1005、1063、1083和1121 cm?1处的分析谱带面积作为关键诊断标志物。随后建立了在主成分空间中数学正交的结构指标Ilac和Iprot。作为初步概念验证，二元逻辑回归模型实现了未干燥乳（包括高温巴氏杀菌样品）与复原乳之间的完全几何分离。在训练数据集内，未干燥乳的假阳性率不超过3.2%，而复原乳分类模型预测的属于复原类别的概率范围为96.8%至99.9%。此外，所提出的指标在根据热处理程度对乳粉进行分类方面显示出巨大潜力。然而，必须在独立商业批次上进行进一步验证，以评估所提方法对基质和仪器变异性的稳健性。

基于拉曼光谱比率指标的乳制品加工历史判别研究——论文解读

一、研究背景与意义

在乳制品行业中，未经授权使用复原乳粉配料仍然是液态乳掺假的一种形式，且难以检测。出于经济动机的乳制品掺假问题依然严峻：使用更廉价的原料降低了生产成本，同时也歪曲了产品的制造方法。因此，开发检测乳粉使用的分析方法成为真实性控制的首要任务。

目前，糠氨酸、乳果糖等通过美拉德反应和乳糖异构化形成的化合物被用于评估乳品所受热处理的强度。然而，这些化合物的水平受累积时间-温度暴露的影响；强化巴氏杀菌、灭菌、浓缩和干燥均可诱导相似的变化，从而限制了单一标志物的特异性。数字比色法结合红外光谱以及三刺激比色法被提出作为替代方案，但所检测参数对产品组成和加工历史变化的稳健性仍需进一步评估。

喷雾干燥及随后的乳粉复水不仅涉及热暴露，还涉及分散体系不同状态之间的转变。水分去除改变了宏量组分的水合条件，导致乳清蛋白变性和聚集，重塑酪蛋白胶束相互作用，并塑造干粉颗粒的结构。复水后，主要组分的质量分数可能接近初始水平，而胶体组织和分子间相互作用不一定恢复到天然乳体系的状态。因此，评估复水不仅应依据单一物质的浓度，还应考虑结构敏感光谱区域的相对响应。

拉曼光谱为此任务提供了有前景的途径，能够无需化学样品制备即可分析水分散体系，并提供蛋白质、碳水化合物和脂质分子振动的信息。然而，传统终产品化学标志物固有地受限于其整合累积热负荷而非区分特定技术转变（如喷雾干燥过程中发生的相变）的特性。为克服这一局限，分析焦点必须从整体浓度转向乳制品基质中潜在的大分子构象和结构组织。

在复杂的异质生物介质中，没有单一光谱谱带能专一对应特定的功能振动。除化学计量学模型外，识别一组有限的、具有清晰解释的物理化学参数也备受关注。乳品中绝对拉曼谱带强度的直接比较因体系的多分散性和光学异质性而复杂化。分散相颗粒尺寸影响信号损失，光谱形状取决于自发荧光、基线校正方法和采样体积的局部组成。在此条件下，比率分析能够在单一光谱内比较特定光谱区域的响应。

与乳品主要宏量组分相关的区域可被选为潜在信息区域。1004 cm^?1附近区域主要与苯丙氨酸芳香环的呼吸振动相关；1070 cm^?1附近的信号包含乳糖吡喃糖环振动的贡献，而1440 cm^?1附近区域反映C–H变形振动，在脂质部分中突出。拉曼图谱揭示的乳品组分空间异质性排除了未经事先验证即将任何谱带视为绝对稳定内标的可能性。因此，喷雾干燥过程中建立的比率差异在复水后是否持续存在，以及它们是否允许区分源自同一初始批次的生乳、巴氏杀菌乳和复原乳，仍未被充分理解。

该研究假设喷雾干燥及后续复水的联合效应改变了乳品体系中蛋白质、碳水化合物和脂质部分的相对拉曼响应，其中部分差异在复原乳中持续存在并可通过比率指标检测。研究目的是识别拉曼光谱中可能适用于生乳、巴氏杀菌乳和复原乳初步区分的比率特征，并评估由两种不同喷雾干燥制度获得的全脂乳粉制备的复水样品之间的差异。

二、主要技术方法

研究人员使用M532拉曼显微镜系统（激发波长532 nm，50×长工作距离物镜，数值孔径0.75，样品表面激光功率≤50 mW，光谱范围160–4200 cm^?1，分辨率4–6 cm^?1）采集乳样拉曼光谱。光谱预处理采用Savitzky–Golay平滑（7点窗口，2阶多项式）、非对称最小二乘（ALS）基线校正及330–4050 cm^?1积分窗口面积归一化。在1000–1160 cm^?1指纹区执行多峰高斯解卷积，提取~1005、~1063、~1083和~1121 cm^?1四个分析谱带的积分面积。基于谱带面积计算碳水化合物指标I_lac（A₁₁₂₁/A₁₀₈₃）和蛋白质指标I_prot（A₁₀₀₅/A₁₀₆₃）。采用主成分分析（PCA）进行坐标旋转以展示指标正交性，并通过二元逻辑回归模型实现类别分离。样本来源为单一均质商业批次生牛乳（来自俄罗斯莫斯科"意大利传统"奶酪工厂），分为六个处理组：生乳对照（H）、76 °C/20 min巴氏杀菌（T-76）、88 °C/5 min巴氏杀菌（T-88）、98 °C/5 min巴氏杀菌（T-98）、出口空气温度≤70 °C喷雾干燥乳粉复水（B-70）及~95 °C喷雾干燥乳粉复水（B-95）。

三、研究结果

3.1 拉曼指纹图谱与结构指标

3.1.1 指纹图谱识别与高斯解卷积

归一化拉曼散射谱（300–4500 cm^?1）显示，所研究乳样保持了特征谱带的基线序列，但其相对份额随食品加工历史动态变化。最显著的变化出现在多组分光谱指纹域（1000–1160 cm^?1），碳水化合物的强伸缩振动与蛋白质和极性脂质功能谱带重叠。通过多峰高斯解卷积，在目标窗口内鉴定出四个高度显著的解析谱带：~1005 cm^?1（苯丙氨酸芳香环对称呼吸振动）、~1063 cm^?1（碳水化合物ν(C–O)_ring和ν(C–C)骨架伸缩组合）、~1083 cm^?1（碳水化合物环骨架伸缩振动）和~1121 cm^?1（糖苷桥连接）。

3.1.2 碳水化合物和蛋白质指标的处理趋势

碳水化合物指标I_lac反映乳糖糖苷键的完整性。生乳的指标值为0.493；加热后（T-76、T-88、T-98）降至0.342–0.404范围，归因于美拉德反应的进展改变了乳糖分子的局部环境。低温干燥样品（B-70）中指标升至0.759，表明温和干燥过程中乳糖转变为玻璃态（无定形态）。高温干燥样品（B-95）中指标降至0.383，推测干燥过程中游离乳糖减少，与变性蛋白质结合。

蛋白质指标I_prot利用1005 cm^?1谱带（苯丙氨酸芳香环振动）并针对1063 cm^?1峰归一化。与生乳（0.422）相比，加热导致指标增加。巴氏杀菌过程中（T-76→T-88→T-98）观察到蛋白质指标的线性剂量依赖性增加，从0.376升至0.675。复原乳（B-70→B-95）显示指标急剧增加：低温干燥（B-70）升至0.978（对照的2.3倍），高温干燥（B-95）达1.840（对照的4.3倍）。在88 °C和98 °C下，乳清蛋白（主要是β-乳球蛋白）发生强烈热变性，蛋白质球展开，暴露先前隐藏的苯丙氨酸残基，增加了1005 cm^?1谱带强度。

3.2 多维投影与二元建模

成对相关矩阵显示初始比率指标具有统计独立性（r = 0.095），表明它们已作为相互正交的轴发挥作用。PCA被用作标准化坐标旋转算子，将独立的碳水化合物和蛋白质方差投影到归一化得分图空间。PC轴1代表施加于样品的总加工负荷的综合指标；所有未干燥液态样品（生乳H；巴氏杀菌样品T-76、T-88和T-98）严格聚集在左半平面（负PC 1值），复水干燥样品（B-70和B-95）沿PC轴1向右移动。PC轴2作为加工制度的差异指标：B-70向上移动，反映乳糖波动伴随相对温和的蛋白质损伤；B-95向下移动，表明蛋白质库的改变在数学上超过碳水化合物的变化。

二元逻辑回归模型建立了分析屏障：Z = 5.0·I_lac + 4.0·I_prot ? 6.0。巴氏杀菌乳簇（包括生乳H）位于左半平面，沿I_prot轴呈线性等容漂移，反映76–98 °C下乳清蛋白库的变性。复原乳样品（B-70、B-95）因脱水过程移入上部区域。逻辑函数中对数几率Y = 10.0·I_lac + 8.0·I_prot ? 12.0。模型验证：T-76的P = 0.004，H的P = 0.029，T-88的P = 0.029，T-98的P = 0.032，B-70的P = 0.968，B-95的P = 0.999。所有未复原乳类型的假阳性概率不超过3.2%，而复原乳的模型预测概率范围为96.8%至99.9%。

四、讨论与结论

4.1 讨论部分总结

在乳品基质的振动光谱中，1000–1160 cm^?1区域是光谱重叠区域，乳糖碳水化合物环的强ν(C–O)和ν(C–C)伸缩振动与极性脂质（磷脂、鞘磷脂）——构成乳脂球膜（MFGM）——的ν_s(PO₂^?)磷酸基团伸缩振动和ν(C–O)酯基伸缩振动信号重叠。1121和1083 cm^?1两个谱带均位于与乳糖吡喃糖环和糖苷键相关的C–O和C–C伸缩振动区域，其比率变化可能反映乳糖晶型（无定形?结晶）或其与蛋白质结合的改变。

归一化程序基于整个光谱（330–4050 cm^?1）的积分面积，导致已知的化学计量学效应——强度分数的再分布——严重干燥样品（B-95）中蛋白质降解和1005 cm^?1峰下降在数学上抬高了乳糖谱带的相对强度。在识别原料技术状态的背景下，此效应不构成方法缺陷，而是作为累积诊断标准，数学上放大非复原与复原体系之间的光谱差异，增加主成分空间中簇之间的几何距离，增强二元逻辑回归模型的判别能力。

研究人员承认若干数学和方法学局限性：分类模型使用源自单一均质生乳批次的同一实验数据集开发和评估，报告的准确率代表重代入（训练）性能而非独立验证性能；样品在二维特征空间中完全分离可能导致最大似然估计的不稳定性；PCA步骤主要作为坐标旋转以展示特征正交性而非真正的独立变量缩减。因此，当前回归模型应被视为初步概念验证。未来必须利用惩罚似然方法（如Firth回归）在大规模独立工业批次上进行验证。

此外，研究人员计划进行掺假"加标实验"，涉及不同污染水平（如5%、10%、20%和50%替代率）的盲编码二元混合物，以建立稳健的定量阈值。遵循ISO 5725指南的多中心验证是该方法被官方食品质量控制体系和监管执法采用之前所严格必需的。

4.2 结论翻译

在本研究中，拉曼光谱结合多峰高斯解卷积和比率分析被成功证明为一种高灵敏度、无损的工具，用于监测乳制品基质中的结构和构象改变。所提出的碳水化合物（I_lac）和蛋白质（I_prot）指标源自关键指纹区（1000–1160 cm^?1），被证明是数学上独立的标志物，能有效捕捉乳糖的相变和乳清蛋白的热展开。作为初步概念验证，多元二元逻辑回归模型建立了清晰的分析边界，实现了未脱水乳池（生乳对照和巴氏杀菌样品）与复原液态乳之间的完全几何分离。尽管所报告的模型预测概率（96.8–99.9%）极具前景，但它们反映了基于单一均质乳批次的内部训练性能。因此，虽然实际化学变化与光谱归一化伪影之间的数学协同作用放大了类间方差，但在独立工业批次上的进一步验证是严格必需的。未来研究必须评估这些比率校准对季节性生物波动、基质组成变异性和仪器漂移的稳健性，以确保该方法可扩展用于自动化食品质量控制体系。