基于高效液相色谱-三重四极杆质谱表征的Dominico-Hartón（Musa AAB）青皮乙醇提取物体外抗氧化活性及其对HMEC-1内皮细胞活力的双向调控效应

《Molecules》：Bioactive Potential and Chemical Composition of Green Peel of Dominico-Hartón (Musa AAB) Ethanolic Extract

Musa AAB是哥伦比亚Quindío地区的重要作物，其果皮作为农工业副产物已被证实含有具有抗氧化特性的多酚类物质，对心血管健康具有重要意义。本研究旨在表征采自Quindío的Dominico-Hartón品种（Musa AAB）青皮乙醇提取物（EEGPP），并评估其抗氧化活性及对HMEC-1细胞活力的影响。EEGPP通过浸渍法（maceration）获得。总酚、黄酮类和糖苷类成分通过分光光度法进行定量；多酚类化合物通过液相色谱-质谱联用技术进行鉴定和定量。抗氧化活性采用DPPH法和硫代巴比妥酸反应物（TBARS）法评估，细胞活力采用磺酰罗丹明B（SRB）法检测。提取物得率为1.37%；提取物中黄酮类和酚类含量较高。鉴定出多种高浓度多酚类化合物：3,5-二羟基苯甲酸、芦丁、对香豆酸和香草酸。该提取物表现出剂量依赖性抗氧化活性，并在HMEC-1细胞暴露24 h后于低浓度下提高细胞活力。上述研究结果表明，Musa AAB来源的EEGPP是具有抗氧化活性生物活性化合物的潜在来源，且能促进HMEC-1内皮细胞活力，值得进一步研究其应用价值。

一、研究背景与立项依据

芭蕉（plantain，煮食蕉）与香蕉（banana，甜食蕉）同属芭蕉科（Musaceae）芭蕉属（Musa），但二者植物化学谱存在显著差异。本研究选用Musa paradisiaca（芭蕉），基因组变种为AAB Dominico-Hartón，该变种的次级代谢产物尚未被充分表征。芭蕉为单子叶植物，是非洲、亚洲和美洲热带地区最重要的粮食安全作物之一。在哥伦比亚，芭蕉产业是社会经济支柱，种植面积超过40万公顷，年产量逾350万吨。其中Dominico-Hartón变种是咖啡种植区和Quindío省的优势栽培品种，占全国产量的65%。

然而，该产业链每年产生约2300万吨废弃物（叶片、假茎和果皮），其中38%未得到任何利用。残余生物质的积累既是环境污染源，也是温室气体的重要来源（占填埋场有机排放的61%），同时还是田间植物病原体的储库。但这些副产物尤其是果皮，富含具有生物学意义的次级代谢产物，如酚类化合物和黄酮类物质，其抗氧化特性与心血管疾病（CVDs）预防相关，而CVDs是全球死亡的首要原因。

CVDs的病理生理学与氧化应激（OS）密切相关，OS诱导内皮功能障碍并促进氧化型低密度脂蛋白（oxLDLs）形成，内皮失去保护作用，这是动脉粥样硬化进展的关键环节。因此，利用植物保护性化合物选择性清除活性氧（ROS）成为保护内皮、预防LDL氧化的有前景的治疗策略。在此药理学路径下，必须通过体外细胞毒性试验验证新植物提取物的生物安全性。在血管研究领域，人微血管内皮细胞系（HMEC-1）保留了正常人内皮的细胞表型特征，是重要的参考模型。目前关于芭蕉的研究多集中于可食部分，而对其果皮化学成分及其作为药物或佐剂开发利用的研究甚少。基于此，研究人员旨在对Dominico-Hartón（Musa AAB）青皮提取物进行化学表征，并评估其抗氧化活性及对人微血管内皮细胞（HMEC-1）的细胞毒性。

二、关键技术方法

研究人员采集Platanillos Crocantes del Quindío公司（哥伦比亚La Tebaida）提供的Dominico-Hartón（Musa AAB）青皮，经清洗、50 °C干燥3天、粉碎后，以96%乙醇浸渍法（maceration）提取10天，旋转蒸发浓缩并干燥获得EEGPP。采用Folin-Ciocalteu法测定总酚，2,4-二硝基苯肼/AlCl₃比色法测定黄酮，苯酚-硫酸法测定糖苷；采用液相色谱-三重四极杆质谱联用（LC-QqQ）在正负离子模式下以多反应监测（MRM）模式对酚类和黄酮类化合物进行鉴定与半定量。抗氧化活性分别采用DPPH自由基清除法和硫代巴比妥酸反应物（TBARS）法评估，后者使用健康志愿者外周血清；细胞活力采用磺酰罗丹明B（SRB）法在HMEC-1细胞系（由安提奥基亚大学提供）中检测，并以广义线性模型（GLM）等进行统计分析。

三、研究结果

2.1 浸渍提取率及次级代谢产物定量：EEGPP为深绿色粉末，提取得率1.37%，总酚含量为67.50 mg GAE/g dw，黄酮含量为992.13 mg CE/g dw，糖苷含量为32.07 mg GE/g dw。上述数值凸显了该变种副产物的抗氧化潜力，并表明黄酮类是所鉴定次级代谢产物中的主要组分。

2.2 LC-QqQ定量酚类与黄酮类化合物：通过LC-QqQ分析，在EEGPP中鉴定并定量了多种酚类化合物和黄酮类物质，其中浓度最高者为3,5-二羟基苯甲酸，其次为芦丁（170 μg/g）等。3,5-二羟基苯甲酸（α-雷琐酸）可激活羟基羧酸受体，减少脂肪细胞脂解并可能改善血脂谱；芦丁（槲皮素-3-芸香糖苷）在高血压和高胆固醇血症等慢性疾病中显示出药理学益处，主要归因于其抗氧化作用。

2.3 生物活性

2.3.1 抗氧化活性：DPPH法结果显示，提取物浓度越高，其对自由基的抑制能力越强，呈剂量依赖性；方差分析（ANOVA）显示0.3、0.7和1 mg/mL浓度间抑制率差异具有统计学意义（0.0005和0.049），但0.3与0.7 mg/mL间无显著差异，且DPPH自由基捕获能力低于70%。

2.3.2 TBARS法：抗氧化能力与提取物浓度呈反比关系，最低浓度0.3 mg/mL时保护活性最高，达86%；浓度增至0.7和1.0 mg/mL时，抗氧化活性百分比分别降至68.55%和53.66%，0.3与1.0 mg/mL间差异具有统计学意义（p < 0.01）。以尿酸为参考标准，其吸光度值（0.0037 ± 0.0011）反映基础脂质过氧化抑制，证实试验化学条件运行良好且可重复。

2.3.3 对HMEC-1细胞系活力的影响：提取物对HMEC-1细胞活力的影响呈暴露时间依赖的双相行为。24 h时，各浓度（0.3、0.7、1.0 mg/mL）均未显示细胞毒性，反而超过未处理对照的活力，其中0.3 mg/mL组细胞活力最高（123.60%），其次为0.7 mg/mL（112.2%）和1.0 mg/mL（108.8%）；阳性对照（10% DMSO）活力显著降低（36.83%），验证了试验有效性。然而暴露48和72 h后，所有处理组均出现显著的时间与剂量依赖性活力下降，72 h时活力降至临界水平：0.7 mg/mL组27.22%、1.0 mg/mL组22.51%、0.3 mg/mL组16.58%。上述结果提示，提取物在急性暴露时提高细胞活力，但长时间接触（>24 h）诱导渐进性细胞死亡过程。

2.3.4 平均细胞抑制浓度（IC₅₀）：仅在48 h暴露时测得IC₅₀值为0.42 mg/mL；24 h时因细胞活力增高（负值）无法计算IC₅₀；72 h时在评估范围内未获得IC₅₀值，因所有浓度所致活力降低均超过70%，超出50%抑制阈值。

四、讨论与结论

讨论部分指出，EEGPP得率1.37%处于文献报道的芭蕉果皮提取物范围内；总酚含量超过既往报道值，证实乙醇具有适于酚类化合物溶解的最佳亲水-亲脂平衡；黄酮含量（992.13 mg CE/g dw）显著高于同种乙醇提取物的既往研究，提示Dominico-Hartón变种具有强健的植物化学谱。LC-QqQ与既往HPLC-DAD、HPLC-ESI-HR-MS及LC-ESI-QTOF-MS/MS研究的定量差异，归因于各技术检测原理不同以及Musa属的代谢可塑性、品种、成熟度和环境条件。糖苷含量与既往报道接近。DPPH清除活性的剂量依赖性及低于70%的捕获能力与Musa balbisiana果皮提取物相似，差异可能源于品种及酚类化合物性质。TBARS试验中高浓度抗氧化效力下降，可由酚类化合物浓度依赖性促氧化效应解释：在Fe-EDTA存在下，高浓度多酚作为强还原剂将Fe³⁺还原为Fe²⁺，加速铁氧化还原循环，增加羟自由基（HO•）生成，超出提取物的清除能力；此外，尚不能排除动力学-化学饱和现象或1.0 mg/mL时色素与脂溶性成分自聚集所致532 nm光谱干扰。HMEC-1细胞试验中24 h活力增高、48和72 h渐进下降的双相模式，可能与复杂植物提取物的物理化学及生物学因素有关（如高浓度下多酚自聚集或微沉淀降低生物可利用部分），亦可能为毒物兴奋效应（hormesis），即低剂量触发适应性或保护性细胞反应而高剂量诱导毒性；24 h增殖增加可能归因于槲皮素和表儿茶素等激活PI3K等增殖信号通路并调节氧化还原平衡，随时间推移ROS和代谢副产物积累超出细胞抗氧化能力导致氧化应激和细胞死亡。研究局限性在于细胞活力仅通过SRB法评估，无法区分细胞静止、凋亡或坏死，今后需结合流式细胞术（Annexin V/PI）、LDH释放及特异性凋亡标志物以阐明48和72 h的细胞死亡机制。本研究首次对哥伦比亚Quindío的Dominico-Hartón品种（Musa AAB）青皮中单个多酚进行详细LC-MS表征，所选HMEC-1模型适用于评估提取物生物活性和血管安全性，并契合可持续发展与循环经济优先方向。

研究结论部分译文：本研究首次对Dominico-Hartón香蕉品种（Musa AAB）青皮乙醇提取物进行了详细的植物化学表征并评估了其生物活性潜力，该农业副产物在哥伦比亚Quindío地区具有重要社会经济影响。所得提取物以高浓度黄酮类和总酚类为特征。通过LC-QqQ分析，鉴定出以3,5-二羟基苯甲酸、芦丁、对香豆酸和反式肉桂酸为主的独特多酚谱。在功能活性方面，提取物在DPPH试验中表现出浓度依赖性抗氧化能力，并在TBARS测定中对脂质过氧化显示出显著保护作用，于低浓度时达到最大效力。HMEC-1细胞评估揭示双相或毒物兴奋效应：急性暴露（24 h）于中等浓度（0.3 mg/mL）提高细胞活力，而长时间处理（>24 h）诱导剂量依赖性细胞毒性（48 h时IC₅₀为0.42 mg/mL）。综上所述，上述发现证实Musa AAB果皮是具有抗氧化植物化学物的有前景来源，能在特定范围内维持血管内皮活力；本研究支持对这些植物残渣进行农工业增值利用，将区域环境负担转化为具有潜在制药、化妆品或食品应用价值的可持续原料。未来需进一步研究以分离特定生物活性组分并阐明内皮增殖的分子机制。