阿拉伯湾海藻来源岩藻黄素及其结构变体的生物活性、UV防护特性、稳定性与化妆品应用潜力

《Molecules》：Fucoxanthin and Its Variants from Seaweeds of the Arabian Gulf: Insight into Bioactivity, UV-Protective Properties, Stability and Cosmetic Potential

　　

对生长于高温、高盐及高UV指数阿拉伯湾的海藻进行色素谱分析显示其岩藻黄素（fucoxanthin）占比较高，提示其潜在的光防护作用。为探究此点，研究人员从10种生长于当地极端环境条件下的海藻中分离出纯岩藻黄素，并评价其抗氧化、UV防护、抗弹性蛋白酶（anti-elastase）、抗胶原酶（anti-collagenase）及抗酪氨酸酶（anti-tyrosinase）特性。岩藻黄素产量与生物活性均呈现显著的种间差异，能够在夏季极端条件下存活的海藻表现出更高的岩藻黄素含量及更强的UV防护特性。分离自Canistrocarpus cervicornis、Feldmannia mitchelliae、Padina gymnospora和Sargassum angustifolium的岩藻黄素表现出较高的抗氧化、抗弹性蛋白酶、抗胶原酶、抗酪氨酸酶及UV防护特性。核磁共振（NMR）结构表征揭示各分离岩藻黄素间R基团存在差异。携带R基团–CH₂OCO(CH₂)₄CH₃（己酰氧基岩藻黄素，hexanoyloxyfucoxanthin）的岩藻黄素衍生物表现出优于含–CH₂OCO(CH₂)₂CH₃（丁酰氧基岩藻黄素，butanoyloxyfucoxanthin）者及含–CH₃母体化合物（岩藻黄素）的生物活性，提示存在构效关系。稳定性研究表明岩藻黄素在高达70 °C下保持稳定，并对H₂O₂等氧化剂具有耐受性；但其对高强度人工UV辐射敏感，且对pH高于5的变化高度敏感。总体而言，上述发现凸显了阿拉伯湾海藻岩藻黄素的结构适应性多样性，并强调了物种选择对最大化生物活性的重要性。

**研究背景与问题**

海洋大型海藻是生物活性化合物的丰富来源，已鉴定出硫酸化多糖、类胡萝卜素、酚类化合物、根皮单宁、植物甾醇及生物活性蛋白等关键组分，具有制药、营养保健品及药妆品应用潜力。在众多生物活性化合物中，海洋类胡萝卜素岩藻黄素因健康促进作用备受关注，其占褐藻总类胡萝卜素的40–70%，在类囊体膜中作为岩藻黄素–叶绿素a–蛋白复合体的捕光与能量传递色素发挥功能。已有研究证实岩藻黄素具有抗癌、抗糖尿病、抗肥胖、抗炎、抗氧化及保肝等作用。其作为化妆品与药妆品配方中海洋来源成分的吸引力源于抗氧化、抗炎、光防护及抗衰老特性；皮肤细胞模型研究表明岩藻黄素可降低氧化应激、促进前胶原合成、抑制基质金属蛋白酶并抑制黑色素生成，动物研究亦证实其可防护紫外线诱导的皮肤损伤、炎症及皱纹形成。全球岩藻黄素市场价值估计为2.0945亿美元，预计未来五年以5%年增长率增长，凸显其在食品、制药及化妆品行业的商业意义。

岩藻黄素已从多种褐藻中分离，多数研究集中于东南亚与欧洲。研究显示岩藻黄素含量随温度、光照、营养水平等环境条件的外在因素及物种等内在因素而变化。尽管其他海域来源岩藻黄素的有益特性已有充分记载，但关于阿拉伯湾海藻岩藻黄素含量与生物活性的信息有限。阿拉伯湾科威特海岸是独特海洋环境，水温（13–36 °C）、盐度（36–44 ppt）及UV指数（8–10）呈显著季节变化。尽管环境条件严苛，该区域仍支持131种海洋大型海藻，包括35种褐藻。海表温度对海藻分布格局起关键作用，多数物种在水温较低的冬季频繁出现，而仅少数适应高水温的物种能在夏季繁盛。该区域大型海藻具有独特酚类组成，黄酮类含量高于以根皮单宁为主温带同类；多数海藻含氢醌（已知皮肤美白剂），这可能是其对极端气候条件的适应。研究人员在该区域大型海藻色素谱研究中观察到，能在UV指数高达10的极端夏季存活的物种岩藻黄素占比较高，由此提出岩藻黄素可能具有UV防护特性的假设。因此，本研究旨在从科威特海岸采集的10种海藻中分离纯岩藻黄素，并比较其抗氧化、UV防护、抗胶原酶、抗弹性蛋白酶及抗酪氨酸酶等生物活性。此外，鲜有研究考察采后贮藏及生物转化过程中可能产生的岩藻黄素结构变异，已知结构变体包括光照或热处理过程中形成的顺/反几何异构体；岩藻黄素体内酶解产生的主要脱乙酰代谢物岩藻黄素醇（fucoxanthinol）及其进一步代谢产物amarouciaxanthin A已被证明具有更高生物活性，但这些衍生物主要在代谢或降解背景下研究，天然存在结构变体的比较分析仍有限。此类变异可能影响岩藻黄素生物活性与UV防护功能，却较少受到关注。因此，本研究采用一维和二维NMR波谱对分离岩藻黄素进行结构表征，并开展稳定性研究以评估其作为化妆品成分的适用性。

**主要关键技术方法**

研究人员于2021年9月至2022年6月间从阿拉伯湾科威特海岸潮间带采集10种褐藻（每种约2 kg鲜重），冻干粉碎后经低温结晶及两次硅胶柱层析（己烷:丙酮7:3）分离纯化岩藻黄素，并采用UHPLC-DAD（离子对法，Zorbax Eclipse XDB-C8柱）测定纯度与含量。生物活性评价包括DPPH自由基清除、金属螯合、还原力及脂质体模型脂质氧化抑制四项抗氧化试验，以大肠杆菌（E. coli ATCC 25922）模型结合高强度宽谱人工UV（250–400 nm）照射评估UV防护，以MMP-1和MMP-12抑制试验评价抗胶原酶与抗弹性蛋白酶活性，以蘑菇酪氨酸酶–L-DOPA体系评价抗酪氨酸酶活性。结构表征采用600 MHz核磁共振（¹H NMR、HSQC、HMBC）。稳定性研究考察温度（20、60、70 °C）、pH（4–11）、人工UV辐射及H₂O₂（0.5%、1%、2%）条件，并以UV-Vis光谱与UHPLC定量分析。数据以平均值±标准差表示，采用单因素方差分析及Tukey多重比较检验（p < 0.05）。

**研究结果**

2.1 不同海藻岩藻黄素的产量与纯度：经低温结晶分离并以己烷:丙酮（7:3）为洗脱液两次硅胶柱纯化的岩藻黄素，HPLC色谱图无共洗脱类胡萝卜素或其他色素类别，单一主峰占总积分峰面积98%，两个次要峰合计占2%，即HPLC面积纯度为98%；分离岩藻黄素与标准品保留时间略有差异，故进行¹H NMR与二维NMR分析。10种海藻岩藻黄素产量差异显著，范围为0.3–2.7 mg/g干重，以P. gymnospora最高（2.7 ± 0.2），其次为S. boveanum、S. aquifolium、F. mitchelliae、S. angustifolium、S. oligocystum和C. cervicornis；S. asperifolium、I. stellata和C. sinuosa含量低且种间无显著差异。

2.2 分离岩藻黄素的抗氧化活性：DPPH自由基清除活性呈浓度依赖性且具种间差异，C. cervicornis岩藻黄素活性最高（最低EC₅₀，0.04 mg/mL），优于合成抗氧化剂丁基羟基甲苯（BHT）（EC₅₀，0.05 mg/mL），其次为F. mitchelliae、S. angustifolium和I. stellata；S. asperifolium最低（EC₅₀，0.56 mg/mL）。铁螯合活性亦呈浓度依赖性，EC₅₀为0.28 ± 0.01至0.65 ± 0.02 mg/mL，C. cervicornis与S. boveanum最高，与已知金属螯合剂乙二胺四乙酸（EDTA）相比无显著差异（p > 0.05），其他物种显著低于EDTA（p < 0.001）。还原力（0.5 mg/mL）为0.14 ± 0.0至0.44 ± 0.03，C. cervicornis、F. mitchelliae、S. oligocystum和S. angustifolium相对较高。脂质体模型中0.1 mg/mL岩藻黄素对硫代巴比妥酸反应物（TBARS）形成的抑制以F. mitchelliae最高，C. sinuosa与P. gymnospora最低；BHT（0.1 mg/mL）抑制率为41.3 ± 1.6%，显著高于岩藻黄素（p < 0.001）。

2.3 分离岩藻黄素对E. coli模型的UV防护作用：含DMSO（不含岩藻黄素）的对照不能保护E. coli免受UV辐射；相反，岩藻黄素可保护E. coli对抗高强度UV辐射。无UV时DMSO导致E. coli存活率下降一个对数级，提示轻度杀菌作用。五种受试海藻中，P. gymnospora岩藻黄素防护作用最强，其次为C. cervicornis、F. mitchelliae和S. angustifolium；S. asperifolium岩藻黄素则无防护作用，表明UV防护效果存在种间差异。

2.4 分离岩藻黄素的抗胶原酶与抗弹性蛋白酶活性：S. angustifolium岩藻黄素弹性蛋白酶抑制率最高（85%），接近已知基质金属蛋白酶（MMP）抑制剂N-Isobutyl-N-(4-methoxyphenylsulfonyl)glycyl hydroxamic acid（NNGH）（96%）；C. cervicornis与F. mitchelliae分别为80%和65%，P. gymnospora为中度抑制（50%），S. asperifolium无抑制作用。胶原酶抑制以P. gymnospora最高（56%），F. mitchelliae与C. cervicornis为40%，NNGH达86%，S. angustifolium与S. asperifolium较低（30%与13%）。

2.5 分离岩藻黄素的抗酪氨酸酶活性：阳性对照曲酸抑制率为83%；P. gymnospora岩藻黄素酪氨酸酶抑制率最高（67%），其次为F. mitchelliae（57%）和C. cervicornis（50%）；S. asperifolium较低（14%），S. angustifolium无抑制作用反而增强酪氨酸酶活性。

2.6 分离岩藻黄素的结构研究：对9种褐藻岩藻黄素进行NMR分析，各分子骨架结构保持一致，但所连R基团不同，据此可分为三组：第一组（C. sinuosa、I. stellata、S. angustifolium和P. gymnospora）R为CH₂OCO(CH₂)₂CH₃（丁酰氧基甲基）；第二组（S. aquifolium、S. boveanum、F. mitchelliae和C. cervicornis）R为CH₂OCO(CH₂)₄CH₃（己酰氧基甲基）；第三组S. oligocystum的R为–CH₃（甲基）。经典岩藻黄素结构（C₄₂H₅₈O₆）R为甲基，与本研究中S. oligocystum分离物对应，其余R基团不同者更宜描述为岩藻黄素衍生物或结构变体。部分分离物HPLC保留时间与Sigma岩藻黄素标准的轻微差异可能源于R基团取代影响极性与色谱行为。C. sinuosa、I. stellata、S. angustifolium和S. aquifolium样品为顺式构型（4.58 ppm峰指示）；S. oligocystum样品在9.40–9.65 ppm区域缺乏共振，因而不含-CHO基团，这是其与其他物种岩藻黄素化学结构最显著的差异。

2.7 分离岩藻黄素的稳定性：以S. angustifolium岩藻黄素进行稳定性研究。H₂O₂处理（0.5%、1%、2%）后UV-Vis光谱无显著变化；HPLC分析显示0.5% H₂O₂下岩藻黄素水平不受影响，1%与2% H₂O₂较对照分别降低4.5%与8.1%。热稳定性（60 °C、70 °C、20 °C）结果显示，60 °C与70 °C加热5 h分别导致含量降低5%与7%；60 °C下第一小时无显著变化，第二小时起逐渐下降，5 h内60 °C降低4–5%、70 °C降低6–7%；室温（20 °C）贮存三天仅降低8%；各温度下UV-Vis光谱均无显著变化。pH稳定性（4–11）结果显示，初始pH为5（对照），降至pH 4时UV-Vis光谱无显著变化，但HPLC显示含量较对照降低27%；pH升至6及以上时UV-Vis光谱与HPLC色谱图出现明显变化，pH ≥6时岩藻黄素降解为多个峰致HPLC定量困难。高强度UV辐射下，暴露第一小时内UV-Vis光谱无显著变化，两小时后出现明显光谱改变，第三、四小时后岩藻黄素完全降解；HPLC定量显示30 min降低16%，随后2 h分别降低20%与27%，第三小时降低97%并持续至第四小时；同时HPLC色谱图中出现两个暂定为顺式岩藻黄素异构体（cis1与cis2）的次要峰。

**讨论与结论**

讨论部分指出，本研究分离的纯岩藻黄素产量显著高于伊朗海岸及印度洋其他海藻的报道，种内与种间产量差异与既往研究一致；P. gymnospora产量最高且为科威特海岸夏季最丰富物种，可能是对包括高UV指数在内的严苛环境的适应，岩藻黄素产量差异可能源于物种、地理位置与季节的综合效应，凸显选择合适物种与季节以最大化提取产量的重要性。抗氧化活性方面，岩藻黄素自由基清除活性呈浓度依赖性，归因于其共轭键、丙二烯键及羟基对自由基的中和作用；C. cervicornis岩藻黄素自由基清除与铁螯合活性较高，铁螯合活性具物种特异性；脂质体模型中岩藻黄素对脂质氧化的抑制低于BHT，岩藻黄素在脂质体系中效果的研究有限且结果常有冲突，需进一步研究。UV防护方面，E. coli模型广泛用于光生物学评估DNA损伤、氧化应激反应与细胞存活，虽非直接模拟哺乳动物皮肤光生物学，但可提供初步机制性筛选；五种海藻的选择基于抗氧化试验活性及自然条件下最高UV指数时的出现情况；P. gymnospora岩藻黄素高含量与UV防护特性可能与其在盛夏存活有关，其防护水平略高于其他物种；S. asperifolium缺乏UV防护作用凸显抗氧化活性尤其是自由基清除活性对UV防护的重要性，岩藻黄素通过清除UV辐射产生的胞内活性氧（ROS）提供UV防护。抗胶原酶与抗弹性蛋白酶方面，弹性蛋白酶与胶原酶是降解细胞外基质关键结构蛋白的两种酶，其失调与炎症性疾病、组织损伤及皮肤衰老相关；S. angustifolium岩藻黄素弹性蛋白酶抑制率接近NNGH，P. gymnospora胶原酶抑制率最高但低于NNGH；既往研究报道岩藻黄素可抑制MMP-2、MMP-9及MMP1，岩藻黄素醇抑制MMP1，局部应用岩藻黄素可缓解日光诱导的皮肤衰老并减少UVB暴露小鼠皱纹；由于多数研究基于动物模型，体外胶原酶与弹性蛋白酶抑制特性研究有限，直接比较具挑战性，不同物种岩藻黄素抑制MMP-1与MMP-12的差异凸显选择合适海藻来源以优化治疗潜力的重要性。酪氨酸酶抑制方面，酪氨酸酶参与黑色素合成，过量黑色素导致色素沉着与黄褐斑等问题；既往研究显示岩藻黄素降低黑色素瘤细胞酪氨酸酶活性与黑色素生成并缓解UVB诱导的色素沉着，P. gymnospora岩藻黄素达到曲酸约三分之二的酪氨酸酶抑制率，但机制尚需进一步研究。构效关系方面，NMR分析揭示所研究海藻中存在岩藻黄素及丁酰氧基岩藻黄素、己酰氧基岩藻黄素等结构变体，后两者曾在棕榈藻（Phaeocystis）等定鞭藻中报道，其在本区域海藻中的存在可能是对阿拉伯湾极端条件的适应；R为CH₂OCO(CH₂)₄CH₃（己酰氧基岩藻黄素）的变体在自由基清除、铁螯合、还原力及弹性蛋白酶抑制中活性最高，R为CH₂OCO(CH₂)₂CH₃（丁酰氧基岩藻黄素）的变体在UV防护、胶原酶抑制及抗酪氨酸酶试验中活性显著，R为–CH₃（经典形式）在测试条件下活性最低；反式异构体比顺式更具生物活性，与既往报道一致；构效关系可归因于R基团引入的理化差异——较长R链增加疏水性，利于深入插入脂质双层并与疏水酶口袋更强相互作用，弹性酶活性位点较胶原酶与酪氨酸酶更疏水，故疏水性增加可提高弹性蛋白酶抑制效力，而较短R基团降低空间位阻并略增极性，可能增强与胶原酶和酪氨酸酶较不疏水结合位点的氢键结合。稳定性方面，0.5% H₂O₂对岩藻黄素稳定性无影响，1–2% H₂O₂影响轻微；与既往报道一致，岩藻黄素在乙醇溶剂中高达75 °C仍稳定，不同温度下UV-Vis光谱无变化提示发色团未发生结构改变，60 °C下5 h降低5%与既往报道的5.3%损失相符；pH对岩藻黄素稳定性的不利影响较温度更明显，岩藻黄素在乙醇中于pH 5稳定，在酸性与碱性极端条件下降解，因多数护肤品配方pH为5，将岩藻黄素纳入此类产品应无稳定性问题；高强度人工UV辐射下岩藻黄素初始降解涉及稳定全反式向可氧化顺式异构体转化，与既往光稳定性研究一致，但本研究中纯岩藻黄素暴露于全波长高强度人工UV（UVA：19.9 W/m²，UVB：21.4 W/m²，UVC：16.84 W/m²），可能解释三小时内快速降解，而科威特海岸自然UV辐射远低（UVA：15.2 W/m²；UVB：0.4 W/m²），故岩藻黄素在防晒乳中的稳定性不大可能成为问题。

研究结论：本研究揭示了岩藻黄素产量与生物活性存在显著物种特异性变异。P. gymnospora岩藻黄素产量与UV防护特性最高，该褐藻繁盛于科威特极端夏季条件，凸显这些类胡萝卜素在海藻生存中的生态意义。不同物种岩藻黄素生物活性差异源于岩藻黄素分子R基团的结构差异，R为CH₂OCO(CH₂)₄CH₃（己酰氧基岩藻黄素）与CH₂OCO(CH₂)₂CH₃（丁酰氧基岩藻黄素）的变体均具生物活性，前者活性更强。岩藻黄素在包括氧化剂与热应激的多种条件下稳定，但对高强度人工UV辐射敏感且对pH高于5的变化敏感；多数护肤品配方pH为5，故将岩藻黄素纳入此类产品不应产生稳定性问题。上述发现提示岩藻黄素作为UV防护、降低氧化应激的天然化合物及化妆品应用潜力。研究亦强调实际应用中审慎选择物种的重要性，因岩藻黄素生物活性因物种而异；P. gymnospora、C. cervicornis、F. mitchelliae和S. angustifolium的岩藻黄素变体尤具前景，因其在E. coli模型中显示UV相关细胞保护活性。本研究局限在于采样期间未系统监测UV辐射及其他环境参数，故无法确定其对观察变异的各自贡献；需进一步研究阐明结构与活性差异的机制，并评估不同物种岩藻黄素及其变体组合以实现增强的UV相关细胞保护及护肤品乳液中的潜在应用。