新疆‘喀什’梨（*Pyrus communis* L. ‘Kashi’）黄酮类成分的分离鉴定、NO抑制活性及分子对接研究

《Molecules》：Flavonoids from Pyrus communis L. ‘Kashi’: Isolation, Structural Identification, NO Inhibitory Activity, and Molecular Docking

　　

新疆梨品种‘喀什’（*Pyrus communis* L. ‘Kashi’）传统上经烤制后食用，用于缓解炎症相关疾患，但其活性成分尚未明确。研究人员采用色谱法分离黄酮类成分，并通过核磁共振（NMR）波谱和高分辨电喷雾电离质谱（HR-ESI-MS）进行结构鉴定。分别采用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）法和Griess法，在脂多糖（LPS）刺激的RAW264.7巨噬细胞中评价细胞毒性和一氧化氮（NO）抑制作用。对接研究针对诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和环氧合酶-2（COX-2）进行。共分离鉴定11个黄酮类化合物，其中4个为首次从梨属（*Pyrus*）中分离并经NMR表征。在100 μM浓度下细胞存活率保持在60%以上。芹菜素（apigenin）、山柰酚（kaempferol）和异鼠李素-3-O-半乳糖苷（isorhamnetin-3-O-galactoside）表现出最强的NO抑制作用，半数抑制浓度（IC₅₀）分别为22.75 ± 3.23、37.54 ± 4.40和58.19 ± 10.41 μM。初步构效关系（SAR）分析提示，化合物1–3中羟基化程度降低以及所考察糖苷中糖链较短，倾向于与较低的归一化NO水平相关；异鼠李素-3-O-半乳糖苷活性高于相应的葡萄糖苷。分子对接揭示了预测配体取向和残基相互作用的差异，提供了互补的定性结构信息。上述发现拓展了‘喀什’梨的黄酮类成分谱，并凸显了初步的NO抑制构效关系趋势。

**研究背景与意义**

梨属（*Pyrus* L.）植物分布广泛，具有悠久的食用和药用历史。在传统中医学中，梨常用于润肺、清心、化痰和降内热。*Pyrus communis* L. ‘Kashi’（当地称‘库克阿木提’）是主要栽培于中国新疆喀什地区的一个独特梨品种，是重要的区域性食药资源。当地传统上将烤梨用于缓解咳嗽、慢性支气管炎和咽喉疼痛，这促使研究人员探究其潜在的抗炎特性。然而，与‘喀什’梨生物活性相关的化学成分，尤其是其潜在抗炎黄酮类成分及其构效关系（SAR），仍表征不足。植物化学研究显示梨属植物含有黄酮类、三萜类和苯丙素类等多种活性成分，其中黄酮类具有包括抗炎在内的广泛生物活性，且依糖基化程度可分为苷元、黄酮单糖苷（FMG）、黄酮二糖苷（FDG）和黄酮三糖苷（FTG），糖基化差异可显著影响其理化性质与生物活性。研究人员前期研究表明，‘喀什’梨的乙酸乙酯部位和正丁醇部位富含黄酮类并抑制LPS刺激RAW264.7细胞的NO生成，为进一步鉴定活性黄酮成分提供了依据。巨噬细胞在炎症反应中发挥重要作用，LPS刺激后产生包括NO在内的炎症介质增多，并伴随诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和环氧合酶-2（COX-2）等炎症相关酶的变化，因此LPS刺激的RAW264.7细胞被广泛用作评价天然产物潜在抗炎活性的体外模型。本研究旨在系统分离鉴定‘喀什’梨黄酮类成分，评价其NO抑制活性，比较结构相关黄酮以考察羟基取代和糖基化与活性的关系，并借助分子对接探索配体-靶标相互作用模式作为补充结构信息，从而明确与该活性相关的结构特征。

**关键技术方法**

研究人员采集新疆喀什地区疏附县‘喀什’梨新鲜果实（凭证标本No. KKA-202311001），以70%乙醇室温浸提，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取；乙酸乙酯部位和正丁醇部位经硅胶柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱、聚酰胺柱色谱、D101大孔树脂柱色谱、反相C₁₈柱色谱及半制备高效液相色谱（HPLC）反复分离纯化；化合物结构经NMR（600 MHz/400 MHz）和HR-ESI-MS确定并与文献数据比对。以LPS（1 μg/mL）刺激的RAW264.7小鼠巨噬细胞为模型，MTT法评价细胞活力，Griess法测定亚硝酸盐以反映NO水平并计算IC₅₀；采用AutoDock Vina对iNOS（PDB: 3E7G）和COX-2（PDB: 3LN1）进行分子对接并以重对接验证方案可靠性；cLogP和拓扑极性表面积（TPSA）以ChemDraw 20.0计算。

**研究结果**

2.1 黄酮类成分的结构鉴定：从‘喀什’梨分离并鉴定11个黄酮类化合物，分别为芹菜素（1）、山柰酚（2）、槲皮素（3）、异槲皮苷（4）、芦丁（5）、槲皮素-3-O-L-阿拉伯吡喃糖基-(1→2)-D-吡喃葡萄糖苷（6）、槲皮素-3-O-[2-O-β-吡喃木糖基-6-O-α-吡喃鼠李糖基]-β-吡喃葡萄糖苷（7）、异鼠李素-3-O-半乳糖苷（8）、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷（9）、异鼠李素-3-O-芸香糖苷（10）和水仙苷（11）。化合物6为首次从梨属分离；化合物7、8和10此前虽经LC-DAD-ESI/MS在梨果皮中被检出，但本研究首次从梨属对其进行了分离和基于NMR的结构鉴定。

2.2.1 黄酮类在RAW264.7细胞中的细胞毒性：以MTT法评价化合物1–11（100 μM）在±LPS条件下的细胞活力。?LPS条件下存活率为63.65%–80.36%，除化合物2外均显著低于正常对照，化合物5最低；+LPS条件下存活率为85.87%–153.39%，多数不低于LPS对照水平，化合物6和10的MTT信号高于LPS对照的100%。两种条件下100 μM时存活率均高于60%，故采用100 μM作为后续NO抑制活性筛选的最高浓度。

2.2.2 对NO生成的抑制作用：以Griess法在100 μM筛选浓度下评价11个黄酮对LPS刺激RAW264.7细胞NO生成的影响。未刺激正常对照（NC）的基线NO水平仅为LPS对照的5.78 ± 0.31%。化合物1、2和8抑制作用最强，归一化NO水平分别为10.09 ± 0.64%、12.92 ± 0.87%和22.22 ± 1.36%（均p < 0.001）；化合物3呈中度但显著的降低（85.88 ± 6.96%，p < 0.05）；其余化合物（4–7、9–11）无显著抑制（NO水平92.06%–107.06%）。?LPS条件下各化合物NO水平为4.92%–6.13%，与NC基线相当（p > 0.05），支持+LPS条件下NO降低反映对LPS诱导NO生成的抑制；由于未进行无细胞亚硝酸盐/Griess干扰对照，不能完全排除化合物对Griess反应的直接化学干扰。对100 μM下抑制最强的化合物1、2和8进行浓度-效应分析，曲线拟合良好（R² > 0.97），IC₅₀分别为22.75 ± 3.23、37.54 ± 4.40和58.19 ± 10.41 μM，Hill斜率分别为1.74 ± 0.34、2.13 ± 0.91和1.57 ± 0.31；相同条件下阳性对照地塞米松IC₅₀为7.4 ± 1.3 μM。化合物1、2和8在6.25–100 μM范围内±LPS条件下存活率均高于70%，支持所观察到的NO浓度依赖性降低并非单纯源于细胞活力丧失。

2.3 构效关系讨论：基于全部11个黄酮的单浓度NO筛选数据进行初步SAR分析，聚焦苷元羟基取代及所连糖基类型与糖链长度。理化参数比较显示活性较强的黄酮苷元一般具有较高cLogP和较低TPSA，糖基化则伴随较低cLogP和较高TPSA；因未直接测定细胞通透性，这些参数仅视为与活性模式相关的理化描述符。2.3.1 羟基位置对苷元NO抑制活性的影响：槲皮素（3）、山柰酚（2）和芹菜素（1）共享相近黄酮骨架，依次缺失C-3′和C-3羟基，其归一化NO水平分别为85.88%、12.92%和10.09%；从槲皮素到缺失C-3′羟基的山柰酚，NO水平由85.88%降至12.92%，进一步缺失C-3羟基的芹菜素为10.09%，较山柰酚低约2.83个百分点。该趋势与既往报道一致，即C-5和C-4′羟基可能有利于活性而C-3′羟基化可能降低活性，C环C-3羟基化与RAW264.7巨噬细胞M1极化抑制减弱相关；化合物1–3中羟基化减少同时伴随较高cLogP和较低TPSA，但未确立因果关系。据此提出仅限于本研究苷元的初步SAR观察：B环C-3′和C环C-3羟基缺失与较强NO抑制活性相关，不应推广至全部黄酮类。2.3.2 糖类型与糖链长度对NO抑制活性的影响：在所考察糖苷中，糖链长度似与归一化NO水平差异相关，槲皮素和异鼠李素系列中单糖苷均倾向于低于相应二糖苷或三糖苷。槲皮素衍生物中，FTG化合物7及FDG化合物5、6的NO水平分别为107.06%、95.78%和101.76%，而FMG化合物4为94.01%；异鼠李素系列中FDG化合物10和11分别为104.95%和107.05%，而FMG化合物8和9分别为22.22%和92.06%。上述比较提示在所试化合物中糖链较短倾向于与较低归一化NO水平相关，与既往报道糖基延伸可降低黄酮苷细胞活性一致，糖链缩短伴随的cLogP升高和TPSA降低也可能参与该趋势。糖构型在单糖苷水平亦似影响活性：化合物8与9具有相同苷元和单个己糖残基，仅糖基C-4′′构型不同，其NO水平分别为22.22%和92.06%，提示糖构型可能促成二者显著活性差异；但该趋势在二糖苷水平未维持，含半乳糖的二糖化合物10（104.95%）仅略低于含葡萄糖的化合物11（107.05%），故FMG水平上半乳糖苷优于葡萄糖苷的表观优势不应推广至更长糖苷。总体而言，本研究得出两项初步SAR趋势：化合物1–3中C-3′和C-3羟基缺失与较强NO抑制活性相关；所考察糖苷中糖链较短倾向于与较低归一化NO水平相关；单糖苷水平上化合物8显著强于相应葡萄糖苷9，但基于单一配对FMG，应视为初步发现而非通则。

2.4 分子对接分析：将化合物1–11对接至iNOS（PDB: 3E7G）和COX-2（PDB: 3LN1）结合位点，仅作定性结构信息，不用于推断细胞效价或作用机制。2.4.1 对接验证：重对接共结晶配体，最佳构象与晶体构象的均方根偏差（RMSD）对iNOS（19个重原子）为0.490 ?、对COX-2（26个重原子）为0.909 ?，均低于常用阈值2.0 ?，支持方案适用于构象预测。2.4.2 结合能分析：化合物1–11与iNOS和COX-2的预测结合能分别介于?7.78至?9.69 kcal/mol和?7.43至?10.33 kcal/mol，且与细胞NO抑制活性并不平行：细胞活性强的化合物8对两靶标结合能最不利（iNOS ?7.78、COX-2 ?7.43 kcal/mol），而细胞活性弱或无活性的芦丁（5）和水仙苷（11）iNOS对接分数较优（?9.69和?9.68 kcal/mol）；细胞活性中度的槲皮素（3）iNOS结合能（?9.36 kcal/mol）强于活性更强的芹菜素（1，?8.78 kcal/mol）和山柰酚（2，?8.68 kcal/mol）。这些差异表明对接分数不应被用于预测细胞NO抑制活性或解释所观察的SAR。2.4.3 结合模式分析：鉴于对接分数与细胞活性缺乏相关性，对预测构象进行定性考察。化合物1–3羟基取代的递变伴随其在iNOS和COX-2中预测取向与接触模式的差异，槲皮素（3）对接分数优于芹菜素（1）和山柰酚（2）却细胞活性较弱，进一步说明预测对接相互作用不直接反映细胞NO抑制活性，故构象差异仅作定性结构观察。糖苷系列中糖链延伸明显改变预测结合构象：iNOS中单糖苷4的黄酮母核占据活性位点内部区域，而二糖苷和三糖苷（5–7）向外偏移、延长糖链伸入口袋并将苷元推向入口；COX-2中化合物4位于口袋内部，5–7采取靠近口袋入口的更外周结合构象；这种糖链驱动的由深部向外周结合偏移与糖苷间细胞活性差异同时出现，但因若干弱活性糖苷仍显示较优对接分数，仅作定性结构提示。单糖苷水平上化合物8和9在两靶标中采取不同预测取向，糖基C-4′′构型差异似改变预测接触分布而未引起对接分数的成比例大幅变化，尽管二者细胞NO抑制活性差异显著；鉴于该比较基于单一配对及计算对接而非直接酶抑制测定，应视为定性结构观察而非半乳糖苷-葡萄糖苷通则证据。

**讨论与结论**

本研究首次对‘喀什’梨黄酮类成分进行系统分离与结构表征，鉴定11个黄酮，涵盖苷元、FMG、FDG和FTG；据研究人员所知，化合物6为首次从梨属分离，化合物7、8和10此前虽经LC-DAD-ESI/MS在梨果皮中检出，本研究首次从梨属对其进行了分离和基于NMR的结构鉴定。LPS刺激RAW264.7巨噬细胞的NO生成评价显示，芹菜素、山柰酚和异鼠李素-3-O-半乳糖苷在所试化合物中抑制活性最强。比较SAR分析在所考察化合物范围内揭示两项主要趋势：化合物1–3中B环C-3′和C环C-3羟基缺失与较强NO抑制活性相关；所考察糖苷中糖链较短倾向于与较低归一化NO水平相关；单糖苷水平上异鼠李素-3-O-半乳糖苷显著强于相应葡萄糖苷，但该观察基于单一配对，不应推广至其他黄酮苷。分子对接表明羟基化和糖基化改变伴随与iNOS和COX-2预测配体取向及残基相互作用模式的差异，但对接分数排序与所试化合物细胞NO抑制活性并不平行，故对接结果提供互补的定性结构信息，而非iNOS或COX-2抑制的直接证据或抗炎机制的实验验证。总体而言，上述发现拓展了‘喀什’梨的植物化学表征，并为其黄酮类成分的NO抑制活性及初步SAR提供了比较信息；尚需进一步实验研究以确立这些细胞效应背后的分子靶标和机制。