血小板衍生细胞外囊泡蛋白标志物用于卵巢癌诊断的验证研究

《Cancers》：Platelet-Derived Extracellular Vesicles for the Diagnosis of Ovarian Cancer

　　

目的：区分卵巢癌与良性和交界性附件病变仍具挑战性。研究人员此前已鉴定出九种与卵巢癌相关的血小板蛋白标志物。本研究旨在验证这些标志物在血小板衍生细胞外囊泡上的表达，并评估其区分卵巢癌与良性和交界性附件病变的能力。方法：研究对象于2021年至2025年间在瑞典乌普萨拉大学医院和耶夫勒医院招募，并根据术后组织病理学诊断进行分组。采用流式细胞术分析无血小板血浆样本。定量检测了血小板衍生EVs（CD41+）及九种血小板蛋白标志物（ACTN4、CRKL、ERP29、GELS、MAP1A、MYCT1、PHB、RELN和SRC）在CD41+CD62P+和CD41+CD62P? EV亚群中的水平。组间差异采用非参数检验、二元和比例优势逻辑回归以及Boruta特征选择进行评估。结果：总CD41+ EVs和CD41+CD62P+ EVs在各组间无差异。CD62P+anti-GELS、CD62P+anti-SRC和CD62P?anti-MYCT1的水平在卵巢癌中最高。CD62P+anti-GELS在粗分析（OR: 1.47, 95% CI: 1.16–1.85; C统计量 0.63）以及校正年龄和CA125后的分析（OR: 1.59, 95% CI: 1.21–2.08; C统计量 0.82）中均与卵巢癌独立相关。Boruta算法将超声评估和CA125列为最重要的变量，其次是CD62P+anti-GELS、CD62P?anti-SRC、CD62P?anti-ERP29、CD62P?anti-MAP1A和CD62P+anti-ACTN4，这些是与卵巢癌相关的变量。CD62P+anti-ERP29与晚期卵巢癌相比其他腹部恶性肿瘤特异性相关（OR: 2.43, 95% CI: 1.53–4.38; C统计量 0.85）。结论：血小板EV上的CD62P+anti-GELS在校正年龄和CA125后与卵巢癌独立相关。它连同CD62P+/CD62P? anti-SRC、CD62P+anti-ACTN4、CD62P?anti-ERP29和CD62P?anti-MAP1A，可能作为超声评估和CA125的补充，用于区分卵巢癌与良性和交界性附件病变。该发现尚需进一步验证。

一、研究背景

尽管诊断和治疗技术不断进步，卵巢癌（ovarian cancer）仍是全球妇科癌症中第二大死亡原因，约75%的患者确诊时已处于晚期。对于表现为附件包块的患者，经阴道超声检查结合特定影像标准是目前诊断附件病变和卵巢癌灵敏度与特异度最高的方法，然而仍有高达20%的病例评估结果不明确。多年来，多项针对卵巢癌筛查方法的尝试均未能成功转化为临床应用。血小板已被证明在癌症转移中发挥多重作用，包括保护癌细胞免受免疫系统攻击、介导信号传导和肿瘤播散、促进上皮-间充质转化以及携带生长因子促进血管生成和转移扩散。特别地，在卵巢癌患者中已证实存在血小板活化现象。研究人员前期通过蛋白质组学方法鉴定出一组能够区分良性卵巢病变与癌症的血小板蛋白标志物，灵敏度达96%、特异度达88%，并能预测早期卵巢癌分期。这些血小板生物标志物同样在血小板衍生细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）上被检出，且能以曲线下面积（area under the curve, AUC）大于0.9的性能区分良性附件病变、交界性肿瘤及各期卵巢癌。后续研究通过定量质谱法进一步鉴定了新的标志物。EVs可在冻存的无血小板血浆中直接分析，无需分离血小板，分析前处理更稳定，同时CD62P状态可同步评估血小板活化程度。本研究旨在评估研究人员前期鉴定的九个血小板蛋白标志物在血小板EVs上的表达及其对卵巢癌的诊断潜力。

二、研究方法概述

这是一项横断面研究，研究对象于2021年12月至2025年5月在瑞典乌普萨拉大学医院和耶夫勒地区医院术前访视期间招募。纳入标准为计划手术治疗的疑似良性、交界性附件病变及所有国际妇产科联盟（FIGO）分期的原发性上皮性卵巢癌患者，年龄至少18岁。术后组织病理学结果用于患者分组。排除标准包括已知的活动性其他恶性肿瘤、缺乏手术组织学结果以及可能影响参与依从性的精神疾病或药物滥用。术后组织学显示其他来源恶性肿瘤的患者作为与III-IV期卵巢癌比较的对照组。基线变量包括年龄、癌抗原125（CA125）以及超声特征，后者分别采用主观分类法和国际卵巢肿瘤分析（IOTA）小组的简易规则进行分类。静脉血采集于枸橼酸钠抗凝管中，经两次离心获得无血小板血浆（platelet-free plasma, PFP），冻存于-70°C。PFP解冻后再次离心去除残留细胞和碎片，取上清液加入含三种抗体混合物的96孔板中。每种混合物包含抗CD41（血小板标志物）、抗CD62P（P-选择素，血小板活化标志物）以及针对九种候选蛋白中三种的抗体。所分析的蛋白包括α-辅肌动蛋白-4（ACTN4）、Crk样蛋白（CRKL）、内质网驻留蛋白29（ERP29）、凝溶胶蛋白（GELS）、抑制素（PHB）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src（SRC）、MYC靶蛋白1（MYCT1）、微管相关蛋白1A（MAP1A）和reelin（RELN）。EVs使用CytoFLEX流式细胞仪进行分析，检测触发信号为紫光侧向散射。EV门使用不同粒径的荧光颗粒进行界定，0.2至1.0微米范围内的事件被视为EVs。血小板衍生EVs定义为CD41⁺事件，并进一步分为CD62P⁺和CD62P^?亚群，在此亚群内量化九种蛋白标志物的水平。结果以EV门内阳性事件的比例（CD41）以及CD41⁺CD62P⁺和CD41⁺CD62P^?亚群中阳性事件的比例表示。统计分析采用Kruskal-Wallis检验、Mann-Whitney检验和Pearson卡方检验进行无序比较；采用比例优势逻辑回归评估血小板EV生物标志物跨患者组的预测价值，提供比值比（odds ratio, OR）和95%置信区间（confidence interval, CI）；应用Boruta算法按重要性对与卵巢癌检测相关的变量进行排序。

三、研究结果

3.1 患者特征

本研究共纳入154例患者。63例良性病变患者中，16例（25.4%）患有子宫内膜异位症。另有19例患者患有不同的腹部恶性肿瘤。患者的年龄在不同组间存在差异，良性病变和I-II期卵巢癌患者年龄最低。CA125值从良性附件病变患者的最低值逐渐升高至III-IV期卵巢癌患者的最高值。

3.2 妇科超声检查结果

通过主观超声检查和IOTA分类，78.1%和76.5%的III-IV期卵巢癌病例被判定为恶性，但在I-II期卵巢癌中这一比例仅为38.5%和46.2%。I-II期卵巢癌在38.5%的病例中被评估为交界性。良性附件病变分别有65.0%和60.7%被评估为良性。

3.3 血小板衍生细胞外囊泡上血小板蛋白标志物的水平

各组间CD41⁺ EVs和CD41⁺CD62P⁺ EVs的水平无显著差异。CD62P⁺anti-GELS、CD62P⁺anti-SRC和CD62P^?anti-MYCT1的水平在卵巢癌组中最高，但这些差异经Bonferroni校正后不再显著。

3.4 血小板生物标志物联合CA125和超声评估的性能

基于预设的疾病进展顺序进行的比例优势回归分析显示，CD62P⁺anti-GELS、CD62P⁺anti-ACTN4和CD62P⁺anti-SRC水平升高与属于更严重疾病类别的几率增加名义上相关。经Bonferroni校正后，仅CD62P⁺anti-GELS与疾病严重程度的关联保持显著。校正年龄和CA125后，该关联仍然显著。进一步校正年龄、CA125以及超声评估后，CD62P⁺anti-GELS的关联减弱且不再显著。Boruta特征选择算法识别出CD62P⁺anti-GELS、CD62P⁺anti-SRC、CD62P^?anti-SRC、CD62P^?anti-ERP29和CD62P^?anti-MAP1A是对患者组分类重要的变量。当加入CA125时，CA125排名最高，其后为CD62P⁺anti-GELS等。加入超声评估后，超声优于CA125，而CD62P⁺anti-GELS等标志物仍被确认为重要变量。在仅限于良性病变、交界性肿瘤和I-II期卵巢癌的分析中，CD62P^?anti-SRC、CD62P⁺anti-ACTN4、CD62P^?anti-ERP29和CD62P^?anti-MAP1A被确认，但CD62P⁺anti-GELS未被确认。

3.5 子宫内膜异位症及其他癌症中的血小板衍生细胞外囊泡生物标志物

在良性附件病变患者中，子宫内膜异位症患者的CD62P⁺anti-PHB水平高于其他良性病变患者，但此关联经校正后不再显著。相比之下，III-IV期卵巢癌患者的CD62P⁺anti-ERP29水平显著高于其他腹腔内恶性肿瘤患者，此发现在逻辑回归分析中得到确认并在多重检验校正后保持显著，表明CD62P⁺anti-ERP29可能有助于区分晚期卵巢癌与其他累及腹腔的恶性肿瘤。

四、讨论与结论

本研究的讨论部分指出，研究人员前期鉴定的血小板蛋白标志物在血小板EVs上的验证表明，CD62P⁺anti-GELS与卵巢癌独立相关，即使在校正年龄和CA125后也是如此。CD62P⁺anti-GELS连同其他几个标志物，有望成为超声评估和CA125的补充标志物，用于区分卵巢癌与良性和交界性附件病变。研究结果进一步支持了血小板在癌症进展中发挥作用的证据。在所有评估的标志物中，CD62P⁺anti-GELS是最强的候选生物标志物，其在良性附件病变向卵巢癌发展的过程中表达增加。GELS是一种肌动蛋白结合蛋白，参与细胞骨架重塑。SRC是另一个有前景的标志物，是一种原癌基因酪氨酸激酶，据报道在晚期卵巢癌中过表达。其他候选标志物包括ACTN4、ERP29和MAP1A，它们各自在细胞骨架组织、蛋白质折叠或微管组织中发挥作用，其在卵巢癌中的具体生物学角色尚不完全清楚。研究意外地未观察到各组间总CD41⁺ EVs或CD62P⁺血小板EVs水平的显著差异，这可能表明存在选择性血小板活化途径的改变而非普遍性活化增强。在特征选择分析中，超声评估的表现优于CA125和血小板EV标志物，这强化了专家超声评估在卵巢癌诊断中的核心地位。研究也指出了若干局限性，包括横断面设计、样本量相对较小、聚焦于大EVs以及样本采集周期较长等。

研究结论：血小板EV上的CD62P⁺anti-GELS与卵巢癌相关，且独立于年龄和CA125水平。CD62P⁺anti-GELS连同CD62P⁺/CD62P^? anti-SRC、CD62P⁺anti-ACTN4、CD62P^?anti-ERP29和CD62P^?anti-MAP1A被确定为在超声评估和CA125之外区分卵巢癌与良性和交界性附件病变的候选标志物。这些有前景的候选标志物仍需进一步验证。