结直肠癌中CTSD相关巨噬细胞状态的单细胞界定与功能验证

《Cancers》：Single-Cell Definition and Functional Validation of a CTSD-Associated Macrophage State in Colorectal Cancer

背景/目的：肿瘤相关巨噬细胞（TAM）异质性可能影响结直肠癌（CRC）的结局。本研究探讨了一种CTSD相关巨噬细胞程序及其功能相关性。方法：将单细胞GSE132465数据（23例肿瘤和10例正常标本）、TCGA结直肠表达与生存数据以及3张空间切片与Scissor、探索性生存建模和巨噬细胞条件培养基实验进行整合。研究人员新增了标本水平伪批量（pseudobulk）表达分析（包括10对匹配的肿瘤–正常样本），并在571例TCGA病例中对Cox模型进行了100次重复的分层十折交叉验证。结果：在45,520个细胞中，识别出一种受生存信息引导的巨噬细胞状态。CTSD和SPP1在10/10对匹配肿瘤巨噬细胞标本中升高（两者配对p = 0.0020），而HSPA1A未显示显著的配对升高（p = 0.131）。单基因CTSD、HSPA1A和SPP1模型的交叉验证C指数（C-index）分别为0.550、0.612和0.533，三基因模型为0.604。将三个基因加入年龄、性别和分期后，交叉验证C指数由0.714升至0.722。Scissor特征选择与下游生存分析复用了同一结局，因此这些结果并非独立的预后验证。CTSD沉默削弱了新收集的巨噬细胞条件培养基支持CRC细胞活力、侵袭和集落形成的能力。结论：CTSD是实验巨噬细胞模型中具有功能相关性的候选分子；临床预测和直接的细胞外CTSD机制仍未得到证实。

结直肠癌（CRC）仍是全球癌症发病和死亡的主要原因之一，其生物学与临床异质性既源于肿瘤细胞改变，也源于周围的免疫与基质生态系统。批量组织图谱分析虽改善了分子分型，但将恶性、免疫和基质区室的信号平均化，限制了对细胞状态特异性程序的解析。肿瘤相关巨噬细胞（TAM）丰度高且高度可塑，依其状态和情境可参与抗原提呈与抗肿瘤免疫，或参与血管生成、细胞外基质重塑、免疫抑制、侵袭及治疗抵抗，而总巨噬细胞丰度或二元M1/M2分类不足以刻画这种异质性。单细胞RNA测序（scRNA-seq）可在细胞分辨率上解析巨噬细胞异质性，Scissor可将单细胞转录状态与患者水平表型关联，空间转录组学则可描述其在组织内的分布，但这些分析仅捕获肿瘤微环境的互补特征，并不能确立因果关系。为此，研究人员在巨噬细胞中心体系中检验CTSD相关信号的功能相关性：先将经PMA分化的THP-1来源巨噬细胞样细胞暴露于CRC细胞系的可溶性因子，随后在HT-29条件化的巨噬细胞模型中沉默CTSD，并评估新收集的巨噬细胞条件培养基对CRC细胞行为的影响，该实验序列在不预设经典M1/M2状态的前提下检验巨噬细胞CTSD扰动对条件培养基活性的贡献。

本研究整合了公共单细胞RNA测序、空间转录组学、TCGA批量转录组与临床数据以及体外巨噬细胞肿瘤条件培养基实验。GSE132465提供33例结直肠组织样本（23例肿瘤、10例正常）用于单细胞分析；GSE280313提供3张空间转录组切片（1张肿瘤、2张配对正常）；TCGA结直肠队列包含701例转录组样本（650例肿瘤、51例非肿瘤），需要临床信息的分析使用有可用数据的子集。新的标本水平巨噬细胞表达分析使用全部33例GSE132465标本，重复Cox模型交叉验证使用571例具有完整生存与临床病理数据的TCGA病例（113例死亡）。

主要关键技术方法包括：单细胞RNA测序数据处理采用LogNormalize标准化、Harmony整合、UMAP与图聚类，并以经典谱系标志物结合SingleR辅助注释，巨噬细胞鉴定依赖C1QA/C1QB、APOC1与CSF1R组合，并以CD68和ITGAM辅助解读；以TCGA-COAD/READ总生存为患者水平表型，用Scissor将批量肿瘤表达、生存结局与整合单细胞表达谱关联，标记Scissor+与Scissor?细胞，并将Mac_Scissor+标志基因集经ssGSEA投影至TCGA肿瘤表达以估计程序相对代表性；采用irGSEA（整合AUCell、UCell、singscore与ssGSEA并经稳健秩聚合）、CellChat、CytoTRACE与Monocle进行通路、通讯与轨迹分析；空间数据经CARD反卷积、SpaTopic与PROGENy分析；差异表达用FindMarkers（Wilcoxon检验，Benjamini–Hochberg校正），候选基因经randomForestSRC生存森林排序；新增按标本汇总巨噬细胞原始UMI计数的伪批量分析（CPM归一化、log2(CPM+1)转换，配对样本用精确双侧Wilcoxon符号秩检验，计数推断用患者区组设计的DESeq2）；并在571例完整病例中对预设Cox模型进行100次事件分层十折交叉验证，以Harrell一致性指数评估。实验方面使用RKO、HCT116、SW480和HT-29四种人CRC细胞系及人单核细胞系THP-1，以100 ng/mL PMA分化THP-1为巨噬细胞样细胞，暴露于含50%条件上清的培养基，随后以siRNA沉默CTSD，并通过qPCR、免疫印迹、ELISA以及CCK-8、Matrigel Transwell侵袭和集落形成实验评估功能。样本队列来源为公共数据库GSE132465、GSE280313与TCGA结直肠队列。

研究结果如下：

3.1 单细胞图谱界定结直肠癌细胞景观。单细胞数据集含10例正常与23例肿瘤结直肠组织样本，45,520个细胞通过质控。样本水平分析显示肿瘤中巨噬细胞比例中位数为6.55%（范围0.96–19.49%），正常样本为2.00%（1.29–3.12%；Wilcoxon p = 0.00030）；10例匹配患者中9例肿瘤组织巨噬细胞比例更高（配对Wilcoxon p = 0.0039）。无监督聚类得到14个簇，注释为11个主要细胞类别。巨噬细胞通过C1QA/C1QB、APOC1与CSF1R组合并结合互补谱系标志物与中性粒细胞及pDC区分，CTSD或CD68单独均不被视为特异。巨噬细胞标志基因富集于补体激活、体液免疫应答、组织重塑及细胞连接相关过程；基于Scissor界定巨噬细胞分区的生存分离，主要细胞区室表型关联筛查将巨噬细胞优先纳入下游分析。

3.2 Scissor识别出与结局相关的巨噬细胞状态，其生存分离对 cutoff 敏感。33例标本的巨噬细胞再聚类为5个转录亚簇；Scissor将3195个巨噬细胞中的1912个标记为Mac_Scissor+（59.8%）、1271个为Mac_Scissor?（39.8%）、12个为背景/未选中（0.4%）；Scissor+巨噬细胞中1832/1912（95.8%）来源于肿瘤组织。在517例TCGA病例中，Mac_Scissor+ ssGSEA特征评分以优化cutoff 0.0382二分时与总生存呈名义关联（高n = 140，低n = 377；log-rank p = 0.0081；单变量HR = 1.72，95% CI 1.15–2.60）；而以固定中位数cutoff 0.0289进行的敏感性分析中两组（258 vs. 259）无显著差异（log-rank p = 0.537；HR = 0.88，95% CI 0.60–1.31），故生存分离依赖cutoff，且细胞状态特征与最优cutoff均参照TCGA生存构建，p值不构成样本外验证。irGSEA显示巨噬细胞相关状态间存在共享及状态特异性通路模式，排名靠前的差异富集基因集在各秩次评分方法间一致。

3.3 Mac_Scissor+巨噬细胞显示独特的通讯与分化特征。CellChat提示广泛的细胞间配体–受体网络，内皮细胞聚合预测通讯评分最高，Mac_Scissor+巨噬细胞类别次之；配体–受体总结识别出SPP1-integrin/CD44、LGALS9-CD44/CD45/HAVCR2、MIF-CD74-CD44/CD74-CXCR4、TNF-TNFRSF1A/TNFRSF1B及VEGFA-VEGFR1/VEGFR2等涉及Mac_Scissor+巨噬细胞作为信号源或靶细胞的互作。在两个展示的组织来源组中，肿瘤来源Mac_Scissor+巨噬细胞的CytoTRACE预测分化相关潜能高于正常来源者，但该横断面比较既不确立干性也不重建真实谱系转变。

3.4 拟时序分析揭示Mac_Scissor+巨噬细胞内的转录异质性。Monocle将Mac_Scissor+巨噬细胞沿分支转录轨迹排序，分支代表该区室内转录不同的状态，横断面设计不确立发育谱系关系。沿推断排序变化的基因形成三个表达簇，TNIP3在轨迹一端较突出，而IGHA1在较晚拟时序区域升高，记录了Mac_Scissor+巨噬细胞内结构化的转录异质性。

3.5 空间转录组描述该巨噬细胞程序的组织情境。对GSE280313中1张原发肿瘤与2张邻近正常切片的空间分析鉴定出12个空间簇；SpaTopic将3张切片划分为CellTopic界定的空间域，主题组成在各切片间不同，反映空间异质性。PROGENy显示通路活性在空间与细胞类型情境间的变异；由于未进行将Mac_Scissor+丰度与单个CellTopic或PROGENy通路关联的正式检验，这些分析仅限组织情境描述，3张切片的样本量亦限制空间推广。

3.6 随机生存森林优先排序CTSD、HSPA1A与SPP1。单细胞分辨率下，1912个Mac_Scissor+与1271个Mac_Scissor?巨噬细胞的差异表达以avg_log2FC > 0.25且校正p < 0.05鉴定出49个基因；SPP1（avg_log2FC = 1.34；阳性细胞59.0% versus 38.2%；校正p = 3.39 × 10^?31）在三个优先基因中变化最大，CTSD（0.36；92.5% versus 86.5%；校正p = 1.54 × 10^?12）和HSPA1A（0.75；64.1% versus 54.3%；校正p = 2.81 × 10^?12）尽管细胞水平p值很小，但单细胞效应量相对温和。在匹配的TCGA批量表达特征上，随机生存森林将HSPA1A（相对重要性1.000）、CTSD（0.663）和SPP1（0.218）排在操作阈值>0.20之上；基因水平中位数二分Kaplan–Meier检验（n = 591；121例死亡）显示CTSD（p = 0.041）、HSPA1A（p = 0.00051）和SPP1（p = 0.040）的名义生存关联，但鉴于复用TCGA生存终点，这些效应估计可能偏于乐观。三个基因分别代表巨噬细胞程序的基质相互作用（SPP1编码骨桥蛋白）、溶酶体功能（CTSD编码组织蛋白酶D）与应激反应（HSPA1A编码应激诱导型热激蛋白）组分。

3.6.1 患者水平伪批量表达支持CTSD与SPP1，但不支持HSPA1A。按组织标本汇总巨噬细胞原始计数得到来自23例患者的33个伪批量谱（23例肿瘤、10例邻近正常），其中10例患者有配对标本。肿瘤与正常标本的中位log2(CPM + 1)表达分别为CTSD 11.49 versus 9.84、HSPA1A 9.23 versus 8.17、SPP1 11.20 versus 0。匹配对中CTSD与SPP1在全部10例肿瘤中升高（两者精确配对Wilcoxon p = 0.00195）；HSPA1A在10对中7对升高但无统计学意义（p = 0.131）。配对DESeq2估计印证CTSD（log2倍数变化1.92；校正p = 6.14 × 10^?5）与SPP1（9.15；校正p = 5.85 × 10^?21），而HSPA1A仍无统计学意义（1.19；校正p = 0.246）。这些标本水平结果确立CTSD与SPP1的肿瘤–正常巨噬细胞表达差异，而非患者水平生存预测或对Scissor界定细胞状态对比的直接验证。

3.6.2 重复Cox交叉验证显示判别能力有限且增量价值有限。在571例完整TCGA病例（113例死亡）中100次事件分层十折交叉验证里，按每SD表达单独建模时平均留出C指数为CTSD 0.550、HSPA1A 0.612、SPP1 0.533，三基因模型达0.604；相应全数据表观C指数分别为0.556、0.616、0.542和0.619。年龄/性别/分期参考模型的交叉验证C指数为0.714，而临床协变量校正模型分别为CTSD 0.717、HSPA1A 0.723、SPP1 0.713及三基因0.722，故加入全部三个基因仅使平均留出一致性提高+0.008。中位数二分单基因模型表现更差（CTSD 0.526、HSPA1A 0.576、SPP1 0.514）。合并C指数的分区间SD为0.0025–0.0083，仅量化重新分区的变异性而非人群外推性；由于基因选择已使用TCGA生存表型，交叉验证针对固定模型的不稳定性与表观–留出乐观偏倚，而非无泄漏的生物标志物发现验证。

3.7 CTSD、HSPA1A与SPP1与不同的免疫细胞谱相关。CIBERSORT估计22种LM22参考免疫表型的相对频率显示，与对照相比肿瘤中推断M0巨噬细胞与活化肥大细胞相对较高，推断初始B细胞与M2巨噬细胞比例较低；LM22的M2类别不等同于SPP1+或Mac_Scissor+巨噬细胞，不能解释为普遍促瘤细胞状态。CTSD、HSPA1A与SPP1与推断免疫细胞比例呈不同相关模式：CTSD与初始B细胞、CD8 T细胞、调节性T细胞、活化NK细胞、M1与M2巨噬细胞、静息树突状细胞及静息肥大细胞正相关，与静息及活化CD4记忆T细胞、静息NK细胞、单核细胞、活化树突状细胞、活化肥大细胞及嗜酸性粒细胞负相关；HSPA1A与初始B细胞、初始CD4 T细胞、调节性T细胞、M2巨噬细胞及静息肥大细胞正相关，与活化CD4记忆T细胞及静息NK细胞负相关；SPP1与静息NK细胞、M0/M1/M2巨噬细胞、活化肥大细胞及中性粒细胞正相关，与记忆B细胞、浆细胞、CD8 T细胞、静息CD4记忆T细胞、调节性T细胞、活化NK细胞、单核细胞、静息与活化树突状细胞及静息肥大细胞负相关。相关分析未确定免疫细胞募集或调控的方向。

3.8 CTSD、HSPA1A与SPP1与不同通路谱相关。GSEA与GSVA显示三个候选基因与通路的关联水平不同。CTSD相关GSEA包括Th1与Th2细胞分化、Toll样受体信号、氮代谢、吞噬体、补体与凝血级联、造血细胞谱系、Th17分化、细胞因子–细胞因子受体互作及抗原相关通路，GSVA将CTSD表达与缺氧及肌生成程序关联。HSPA1A相关GSEA包括黏着斑、整合素信号、细胞外基质受体互作、细胞骨架调控及肌动蛋白细胞骨架通路，而核糖体、细胞周期与氧化磷酸化呈负富集，GSVA将其与顶端连接及肌生成程序关联。SPP1相关GSEA包括细胞外基质受体互作、Toll样受体信号、IL-17信号、吞噬体、整合素信号、黏着斑、细胞因子–细胞因子受体互作及抗原加工与提呈，GSVA将其与上皮–间质转化及炎症反应关联。这些观察性通路结果并非基于扰动的通路验证。

3.9 CRC细胞条件培养基改变巨噬细胞样细胞中CTSD、SPP1与HSPA1A。PMA分化的THP-1来源巨噬细胞样细胞暴露于RKO、HCT116、SW480和HT-29条件培养基，以未暴露CRC条件培养基的PMA分化细胞为基线对照。免疫印迹显示，相对于未条件化对照（1.00），CTSD/GAPDH在RKO-CM为2.11、HCT116-CM为0.89、SW480-CM为1.78、HT-29-CM为3.05；相应SPP1/GAPDH为0.63、1.43、0.46和1.03，HSPA1A/GAPDH为0.54、0.63、0.32和0.93。故HT-29-CM引起最大的CTSD蛋白反应，而SPP1与HSPA1A呈不同、非平行的蛋白水平模式。ELISA显示暴露于CRC条件培养基后总细胞外CTSD、SPP1与TNF-α浓度高于未条件化巨噬细胞对照，HT-29-CM条件下细胞外信号组合最强；由于未单独测定输入CRC条件培养基，该结果为总回收分析物而非巨噬细胞特异性分泌，但结合图9C中显著的巨噬细胞CTSD蛋白反应，支持选择HT-29-CM条件化模型进行CTSD敲低。

3.10 CTSD敲低降低巨噬细胞条件培养基的促瘤活性。HT-29-CM暴露的THP-1来源巨噬细胞样细胞转染非靶向siRNA（si-NC）或三种CTSD靶向siRNA之一，三次原始免疫印迹重复显示GAPDH归一化CTSD丰度为1.000 ± 0.037（si-NC）、0.858 ± 0.017（si-CTSD1）、0.518 ± 0.026（si-CTSD2）和0.468 ± 0.018（si-CTSD3；均值±SEM，n = 3），对应蛋白降低14.2%、48.2%和53.2%；蛋白降低最大且转录抑制最强的si-CTSD3被选入下游功能实验。经培养基洗脱并新收集24 h后，CTSD沉默降低了巨噬细胞条件上清中检测到的CTSD，并伴随SPP1与TNF-α浓度降低，提示CTSD扰动改变HT-29条件化巨噬细胞样细胞培养的可溶性因子谱，但不确立SPP1或TNF-α是CTSD的直接下游底物或介导者。将来自si-NC与CTSD沉默的HT-29条件化巨噬细胞样细胞的新收集条件培养基转移至CRC受体细胞，与si-NC来源培养基相比，CTSD沉默的巨噬细胞培养基在48与72 h降低CRC细胞活力，并减少Matrigel Transwell侵袭与集落形成；三个功能读出的一致效应表明，在肿瘤条件化巨噬细胞样细胞中沉默CTSD削弱了所得条件培养基的促瘤活性。

讨论部分总结：本研究识别出富集CTSD、HSPA1A与SPP1的Mac_Scissor+巨噬细胞状态，并在条件培养基模型中检验巨噬细胞CTSD沉默的功能后果。由于Scissor使用TCGA总生存分配细胞状态，后续同队列富集评分比较、随机生存森林优先排序与Cox关联均为内部选择且可能偏乐观；优化评分cutoff产生分离而固定中位数cutoff未产生分离。全部巨噬细胞的患者水平伪批量比较独立支持肿瘤相关CTSD与SPP1表达，但HSPA1A在匹配标本中不显著。对固定Cox设定的重复十折交叉验证减少了对表观一致性的依赖，但仅基因判别能力有限，且将三基因加入年龄、性别与分期仅使C指数改变0.008；由于Scissor/RSF特征选择未在训练折内重复，研究仍支持候选发现而非预后特征验证。巨噬细胞异质性不能由二元M1/M2命名充分代表，单细胞状态标签并非不可变谱系；SPP1/TREM2富集状态可能反映基质重塑等肿瘤相关程序，基于表达的相关不能确立其执行特定免疫抑制功能。肿瘤细胞条件培养基在THP-1来源巨噬细胞样细胞中产生不同的CTSD、SPP1与HSPA1A表达反应，HT-29-CM引起细胞内CTSD蛋白最大升高而非平行的SPP1与HSPA1A免疫印迹谱。最重要的功能观察在CTSD敲低后获得：去除原处理培养基并新收集培养基后，所得巨噬细胞条件培养基支持CRC细胞活力、侵袭与集落形成的能力下降；该序列超越转录组关联，证明巨噬细胞CTSD扰动改变该模型分泌组的促瘤特性，而无需假定M2极化状态。供体水平伪批量肿瘤–正常分析支持匹配组织标本中巨噬细胞CTSD表达的可重复升高，但不确立CTSD可区分患者内生存界定状态或THP-1培养重现特定患者巨噬细胞状态，故单细胞Scissor+ versus Scissor?的温和CTSD效应仍是重要解释约束。组织蛋白酶D是参与蛋白稳态、细胞外基质相关过程及肿瘤–基质生物学的溶酶体蛋白酶；在巨噬细胞聚焦的扰动体系中，si-CTSD3降低细胞CTSD及随后收集的条件培养基中CTSD浓度，同一培养基在互补CRC细胞实验中促瘤活性降低，支持CTSD在HT-29条件化巨噬细胞样体系中的功能作用；但CTSD表达改变可影响巨噬细胞分泌组的多个组分，现有实验不能区分间接效应与细胞外CTSD对CRC细胞的直接效应。CTSD敲低后SPP1与TNF-α浓度降低与巨噬细胞条件可溶性微环境更广泛改变一致，但并不意味着已证实CTSD–SPP1信号层级。HSPA1A是应激诱导型伴侣蛋白，其批量表达与黏附、基质及细胞骨架通路相关；其在本研究中的作用为关联性，配对伪批量比较未证实肿瘤巨噬细胞中HSPA1A显著升高，且未进行HSPA1A扰动。SPP1信号并非巨噬细胞特异，现有图示显示其他细胞群体也贡献SPP1表达；表达SPP1的巨噬细胞未仅凭表达被归类为经典M2细胞。空间反卷积、生态域与推断通路足迹仅来自3张切片（1张肿瘤、2张正常），未建立Mac_Scissor+程序与空间域或PROGENy通路的正式统计联系，推断的上皮通讯未限于独立验证的恶性细胞。主要局限在于可推广性与分子分辨率：受生存信息引导的Scissor选择、下游候选排序与生存检验复用TCGA终点；患者水平肿瘤–邻近正常伪批量检验与固定候选Cox模型的重复交叉验证均未在不复用结局的情况下检验受生存信息引导的细胞状态选择；外部预后验证与嵌套端到端发现验证仍缺失，优化评分cutoff在中位数切分下未重现其生存分离；伪批量检验评估肿瘤–正常巨噬细胞表达而非CTSD/HSPA1A/SPP1生存效应，HSPA1A在配对供体水平检验中未达显著；候选基因C指数有限，超出年龄、性别与分期的改善很小；空间数据集仅3张切片；体外工作使用标准化PMA分化THP-1巨噬细胞样体系暴露于HT-29-CM，未直接重现或功能分离患者来源Mac_Scissor+状态；功能实验使用三种筛选中CTSD siRNA中最有效者，无第二序列功能重复或挽救；初始肿瘤CM暴露ELISA未分离输入肿瘤来源与巨噬细胞来源分析物，也未进行额外极化状态比较。上述局限限定了发现的分子特异性与更广泛转化，但不否定所记录的CTSD敲低与CRC功能实验中可重复的方向性变化。总体而言，数据将CTSD相关巨噬细胞程序列为后续研究优先对象，并显示巨噬细胞CTSD沉默改变随后收集的巨噬细胞条件培养基支持CRC细胞表型的能力；这些数据不验证独立患者风险预测、M2特异性通路或直接细胞外CTSD因果关系。

研究结论翻译：整合单细胞、批量转录组与空间分析，在结直肠癌中识别出一种CTSD相关巨噬细胞程序。患者水平巨噬细胞伪批量检验证实CTSD与SPP1的肿瘤相关升高，但HSPA1A未见升高；重复内部Cox交叉验证显示基因特异性判别能力有限，且超出年龄、性别与分期的附加预测价值极小。关键在于，在HT-29条件化巨噬细胞样细胞中沉默CTSD，降低了随后收集的条件培养基在CRC细胞活力、侵袭和集落形成实验中的促瘤活性。这些功能结果确立CTSD是巨噬细胞条件化模型中相关的实验靶点，而外部或完全嵌套的选择无关临床验证及更多机制研究仍是确立患者水平预后性能和直接CTSD介导信号所必需的。